Structure and function of hemoproteins from Antarctic marine organisms

Project leaders

Vincenza Verde, Dari'o Ariel Estrin

Agreement

ARGENTINA - CONICET - Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas

Call

CNR/CONICET 2013-2014

Department

Earth and Environment

Thematic area

Earth system science and environmental technologies

Status of the project

New

Research proposal

Le regioni polari sono un laboratorio ideale per lo studio multidisciplinare delle conseguenze dei cambiamenti climatici in atto sull’adattamento evolutivo ed offrono l’opportunità di studiare a livello molecolare l’adattamento alla temperatura. La maggior parte delle conoscenze che noi abbiamo acquisito sugli effetti dell’ambiente sulla fisiologia ed evoluzione dei vertebrati deriva dagli studi condotti sui pesci. In aggiunta, i geni e le proteine dei pesci polari offrono opportunità per conoscere l’adattamento evolutivo alla temperatura nei vertebrati (1).Il sangue dei pesci antartici ha proprietà differenti da quello dei teleostei di acque temperate e tropicali, contiene meno eritrociti e meno Hb (2). Questa strategia adattativa consente di alleggerire notevolmente lo sforzo cardiaco necessario per pompare il sangue in circolo. Un classico esempio di come la temperatura abbia influenzato l’evoluzione in Antartide è rappresentato dalla famiglia dei teleostei marini Cannictiidi, denominati anche “icefish”, gli unici vertebrati al mondo il cui sangue incolore è privo di Hb e di globuli rossi. Questo clade ha perso i geni per l’Hb, ed in molte specie della famiglia anche la capacità di esprimere la mioglobina. Il trasporto dell’O2 avviene unicamente mediante diffusione nel plasma sanguigno. La recente scoperta del gene della neuroglobina (Ngb) nel cervello di alcuni pesci Antartici a sangue rosso e nel cervello di almeno 13 delle 16 specie di “icefish”, ha importanti implicazioni nella nostra conoscenza sulla funzione svolta da questa proteina (3). La Ngb è una emoproteina che possiede il classico “folding 3 on 3”. La proteina lega O2 e altri ligandi; il gene è trascrizionalmente indotto da ipossia ed ischemia (4). La Ngb gioca un ruolo neuroprotettivo durante lo stress da ipossia. Sono stati suggeriti anche altri ruoli trasduzione del segnale, regolazione dell’apoptosi e protezione da malattie neurodegenerative, (5), ma il ruolo della Ngb non è ancora completamente conosciuto. Recentemente sono state scoperte Hb anche nei batteri, alcune delle quali, definite Hb “2 on 2” (2/2Hb), hanno una funzione diversa dal trasporto dell’O2. Molti batteri possiedono anche Hb chimeriche, le flavoHb, la cui funzione è probabilmente quella di enzimi detossificanti per il monossido di azoto. La recente pubblicazione della sequenza del genoma di Pseudoalteromonas haloplanktis TAC125 (TAC125) offre un’occasione unica per esplorare le strategie cellulari adottate dai batteri psicrofili (6). TAC125 è uno psicrofilo isolato da acque costiere vicino alla stazione antartica francese Dumont d’Urville, in Terra di Adélie, che vive in permanenza a temperature vicine al punto di congelamento dell’acqua. TAC125 risponde all’aumentata solubilità dell’O2 a bassa temperatura mediante grande attività di “scavenging” dell’O2 ed assenza di meccanismi (sintesi di molibdopterina ed enzimi contenenti molibdopterina) che producono le specie reattive dell’O2 (ROS). La funzione fisiologica di queste emoproteine è pertanto ignota e potrebbe essere quella di “trappola” per ligandi gassosi, come O2, monossido di carbonio (CO) o monossido di azoto (NO), ma anche di metallo-enzima (perossidasi o NO-reduttasi). L’analisi in silico condotta sul genoma di TAC125 ha rivelato la presenza di tre geni che codificano 2/2Hb e un gene che codifica una flavoHb, proteina chimerica con un dominio globinico nella parte N-terminale e un dominio con attività riducenti nella porzione C-terminale. Contrariamente alle globine classiche, le flavoHb contengono una porzione C-terminale con siti di legame per NAD(P)H e FAD. L’analisi della struttura primaria delle tre Hb di TAC125 ha mostrato importanti differenze in alcune posizioni considerate specifiche. Da questa analisi, mediante allineamento con ClustalX ed utilizzando un “data set” con Hb da vari batteri, risulta che in TAC125 due Hb appartengono ad un gruppo (II) mentre la terza al gruppo (I). L’attenzione è stata rivolta ad una delle Hb presenti nel genoma di TAC125 appartenente al gruppo II, che è la prima Hb da batterio “cold adapted” ad essere studiata (7, 8, 9). Nel laboratorio del gruppo italiano del CNR di recente è stato clonato il gene codificante una delle emoproteine. La proteina ricombinante, purificata ad omogeneità, è stata caratterizzata strutturalmente mediante dicroismo circolare, spettroscopia UV-VIS, Raman e tecniche di “flash” fotolisi con laser e “stopped flow”.
 Risultati previsti
Il raggiungimento di questi obiettivi richiede un approccio multidisciplinare tra gruppi di ricerca che hanno competenze diverse come il gruppo italiano (Napoli) in collaborazione con l’Università di Parma (Prof. Viappiani) ed argentino che hanno lunga tradizione nello studio delle emoproteine, come dimostrato dalle pubblicazioni su riviste internazionali di alto livello.  Questi gruppi coopereranno per raggiungere l’obiettivo di ottenere una caratterizzazione strutturale e funzionale delle 2/2Hb batteriche e della Ngb da icefish. Inoltre tutte queste indagini verranno effettuate in paragone con altre emoproteine da organismi temperati al fine di determinare gli aspetti funzionali comuni e specifici delle emoproteine di origine antartica. La collaborazione con il gruppo argentino sarà importante per il “training” di studenti PhD e post-doc Italiani, permettendo loro di poter aumentare le conoscenze scientifiche al progetto. I risultati ottenuti infine saranno diffusi attraverso pubblicazioni su riviste internazionali.
Razionale
L’obiettivo fondamentale di questo progetto consiste nel comprendere la funzione delle emoproteine in ambienti termostabili come quello antartico.. Per tale fine il progetto usa una strategia basata nella combinazione di tecniche sperimentali e di simulazione computazionale ibrida quantico-classica. La presente proposta è centrata sullo studio di due emoproteine di grande interesse. Lo scopo del progetto sarà quello di esplorarne la struttura, la dinamica e la reattività mediante tecniche di simulazione computazionale grazie al gruppo argentino e attraverso un’ampia gamma di tecniche sperimentali fornite dai gruppi italiani. Il gruppo argentino è leader a livello mondiale nello sviluppo e nell’applicazione di tecniche di simulazione computazionale nell’ambito delle emoproteine. I gruppi italiani hanno una grande esperienza nella biochimica di emoproteine. Il gruppo del CNR di Napoli ha uno status internazionale nello studio delle emoproteine cold-adapted. Il gruppo dell’Università di Parma è leader a livello mondiale nello studio delle proprietà di legame delle emoproteine. L’associazione dei gruppi italiani e del gruppo argentino è altamente complementare, date le loro capacità ed esperienze, e permette di fondere una squadra altamente competitiva a livello internazionale nell’area della biochimica e della biofisica di emoproteine. Il finanziamento del progetto di cooperazione internazionale rafforzerà il processo di collaborazione che ci permetterà di affrontare con maggiore successo e sinergia problematiche ancora aperte nel vasto campo delle emoproteine. Delle attività proposte nel progetto, è previsto che
-         le attività 1 e 2 si realizzeranno presso l’Istituto di Biochimica delle Proteine (IBP) del Consiglio Nazionale delle Ricerche (CNR) di Napoli e presso il gruppo di ricerca del Prof. Viappiani (Università di Parma).
  Referenze
(1) Verde, C.; Giordano, D.; di Prisco, G. IUBMB Life, 2008, 60, 29-40.
(2) di Prisco, G.; Eastman, JT.; Giordano, D.; Parisi, E.; Verde, C. Gene 2007, 398, 143-155.
(3) Verde, C.; Cheng, C.; di Prisco, G. IUBMB Life, 61: 184–188. 
(4) Hankeln, T.; Ebner, B.; Fuchs, C.; Gerlach, F.; Haberkamp, M.; Laufs, T.; Roesner, A.; Schmidt, M.; Weich, B.; Wystub, S.; Saaler, S.; Reuss, S.; Bolognesi, M.; De Sanctis, D.; Marden, M.; Kiger, L.; Moens, L.; Dewilde, S.; Nevo, E.; Avivi, A.; Weber, R.; Fago, A.; Burmester, T. J. Inorg. Biochem. 2005, 99, 110-119.
(5) Brunori, M.;Vallone, B.; Cell. Mol. Life Sci. 2007, 64, 1259-1268.
(6) Médigue, C.; Krin, E.; Pascal, G.; Barbe, V.; Bernsel, A.; Bertin, P.N.; Cheung, F.; Cruveiller , S.; D’Amico, S.; Duilio, A.; Fang, G.; Feller, G.; Ho, C.; Mangenot, S.; Marino, G.; Nilsson, J.; Parrilli, E.; Rocha, E.P.C.; Rouy, Z.; Sekowska, A.; Tutino, M.L.; Vallenet, D.; von Heijne, G. and Danchin, A. Genome Res. 2005, 15, 1325-1335
(7) Giordano, D.; Parrilli, E.; Dettai, A.; Russo, R.; Barbiero, G.; Marino, G.; Lecointre, G.; di Prisco, G.; Tutino, L.; Verde, C. Gene, 2007, 398, 69-77.
(8) Howes BD, Giordano D, Boechi L, Russo R, Mucciacciaro S, Ciaccio C, Sinibaldi F, Fittipaldi M, Martí MA, Estrin DA, di Prisco G, Coletta M, Verde C, Smulevich G (2011) The peculiar heme pocket of the 2/2 hemoglobin of Antarctic cold-adapted Pseudoalteromonas haloplanktis TAC125. J Biol Inorg Chem 16, 299-311
 (9) Giordano D, Russo R, Ciaccio C, Howes BD, di Prisco G, Marden MC, Hui Bon Hoa G, Smulevich G, Coletta M, Verde C (2011) Ligand- and proton-linked conformational changes of the ferrous 2/2 hemoglobin of Pseudoalteromonas haloplanktis TAC125. IUBMBLife 63, 566-73
(10)  Nadra, A.; Marti, M.A.; Pesce, A.; Bolognesi, M.; Estrin, D. Proteins, 2007, 71, 695-705
 

Research goals

Obiettivo generale di questo progetto italiano (gruppo Dr. Verde, CNR) e gruppo del Prof. Viappiani, Università degli Studi di Parma in collaborazione con il gruppo del Prof. Estrin è contribuire allo i) studio biofisico e cinetico della stabilità e della dinamica di “binding” della Ngb di “icefish”; ii)studio biofisico e cinetico della stabilità e della dinamica di “binding” delle 2/2Hb di TAC125 “wild type” e di suoi mutanti, in relazione alla “cold-adaptation”

Last update: 18/04/2024