Caratterizzazione di un RNA circolare infettivo associato alla malattia del mosaico nanizzante del gelso in Cina

Responsabili di progetto

Beatriz Navarro, Wenbing Wang

Accordo

CINA - CAAS-not in force - Chinese Academy of Agricultural Sciences

Bando

CNR/CAAS 2011-2013

Dipartimento

Agroalimentare

Area tematica

Scienze bio-agroalimentari

Stato del progetto

Nuovo

Proposta di ricerca

Gli RNA di tipo viroidale includono i viroidi, gli RNA satelliti di tipo viroidale e gli elementi retroviroidali. Sono tutti RNA circolari di piccole dimensioni che non codificano proteine e che, pur condividendo alcune proprietà strutturali, si differenziano da un punto di vista biologico.
I viroidi sono RNA infettivi non incapsidati che possono determinare gravi malattie nelle piante. Alcuni di essi contengono elementi strutturali con proprietà catalitiche (ribozimi a testa di martello) implicate nella replicazione mediata da un meccanismo di circolo rotante. Nei tessuti infetti si identificano due polarità dello stesso RNA e, per convenzione, si considera quella più abbondante come la polarità positiva. Le circa 30 specie viroidali conosciute si raggruppano nella famiglia Pospiviroidae, che include i viroidi che non contengono ribozimi a testa di martello e la cui replicazione ed accumulo sono nucleari, e la famiglia Avsunviroidae, i cui membri si replicano e si accumulano nel cloroplasto e presentano ribozimi a testa di martello negli RNA di entrambe le polarità (Flores et al., 2005. Annu RevPhytopathol 43:117–39).
Gli RNA satelliti di tipo viroidale hanno proprietà catalitiche, biochimiche e strutturali simili ai viroidi. Come gli Avsunviroidae, alcuni RNA satelliti di tipo viroidale contengono ribozimi a testa di martello in entrambe le polarità. Altri, però, presentano il ribozima a testa di martello solo nella polarità positiva, mentre la polarità negativa contiene un ribozima diverso (ribozima hairpin), oppure ne è priva. I viroidi si differenziano dagli RNA satelliti di tipo viroidale perchè questi ultimi sono funzionalmente dipendenti da un virus ausiliario che deve coinfettare le cellule dell’ospite (Symons and Randles, 1999. Curr Top Microbiol Immunol 239: 81-105). Infine, biologicamente differenti dai viroidi e dai satelliti di tipo viroidale sono gli elementi retroviroidali (retroviroid-like) che, pur contenendo ribozimi a testa di martello in entrambe le polarità, sono RNA non  infettivi con una controparte di DNA integrata nel genoma dell’ospite (Hegedus et al., 2004. Virology 325: 277-86 ).
Appare, quindi, evidente che la dimostrazione conclusiva della natura viroidale di un RNA circolare risiede, più che nelle sue proprietà strutturali, in quelle biologiche: gli RNA viroidali sono gli unici RNA circolari in grado di replicarsi nell’ospite in assenza di un virus ausiliare. Solamente l’inoculo nell’ospite sano di RNA viroidali opportunamente purificati o trascritti in vitro, fornisce la prova definitiva sulla natura di un RNA circolare e sulla sua capacità di determinare una malattia.
L’industria della seta è di rilevante importanza in Cina. Le larve del baco da seta si nutrono di foglie di gelso, una pianta coltivata da oltre 10 secoli. Agli inizi degli anni ’90, i ricercatori cinesi con i quali si intende realizzare il presente programma di ricerca hanno identificato nella provincia di Zhejiang, Cina, piante di gelso con gravi sintomi di mosaico e di nanismo. Recentemente, hanno osservato che la malattia si sta diffondendo in altre importanti aree di produzione della seta in Cina. Dopo aver dimostrato che la malattia è trasmissibile per innesto, gli stessi ricercatori hanno isolato dai tessuti sintomatici di gelso un RNA circolare che è stato solo parzialmente caratterizzato e denominato Mmd-v RNA1. L’inoculo di RNA estratti dalle piante sintomatiche in piante sane ha consentito la trasmissione a queste ultime dell’RNA di tipo viroidale che, a distanza di due anni, è stata seguita dalla manifestazione dei sintomi. Su questa base, i colleghi cinesi hanno avanzato l’ipotesi che la malattia del gelso in questione sia di natura viroidale (Wang et al., 2010. Polish J. Microbiol. 59: 33-36).
Le caratteristiche strutturali di questo potenziale nuovo viroide sono però del tutto inattese. Si tratta di un RNA di piccole dimensioni (356 nt) che non presenta nessun elemento strutturale tipico dei Pospiviroidae. Inoltre, sebbene una nostra attenta analisi della sequenza nucleotidica di Mmd-v RNA1 (Accession number: NC_01362) abbia evidenziato la presenta di un ribozima a testa di martello in una polarità, l’altra polarità dello stesso RNA, a differenza di tutti gli Avsuviroidae finora descritti, non contiene alcun ribozima a testa di martello. Pertanto, se si dovesse confermare la natura viroidale di questo RNA, si tratterebbe di una specie assolutamente nuova che potrebbe costituire il capostipite di una nuova famiglia di viroidi. Una novità di notevole rilievo da un punto di vista biologico ed evolutivo. Prima di considerare questa eventualità, è sicuramente necessario realizzare studi più approfonditi che potrebbero riservare ulteriori interessanti sorprese. Infatti, non si può escludere che Mmd-v RNA1 in una delle due polarità contenga un ribozima non conosciuto. Inoltre, se effettivamente una delle due polarità manca di ribozima, la possibilità che si tratti di un RNA satellite andrebbe attentamente riconsiderata. A tal fine è necessario dimostrare in maniera convincente che l’infettività di Mmd-v RNA1 non dipende dalla coinfezione di un virus ausiliario non descritto.
Il presente progetto si propone lo scopo di determinare in maniera definitiva la natura biologica di Mmd-v RNA1 e di studiare a fondo le sue caratteristiche molecolari. Il gruppo italiano è costituito da ricercatori con lunga esperienza nell’isolamento e nella caratterizzazione biologica e molecolare di RNA di tipo viroidale da piante erbacee ed arboree e nello studio dei ribozimi (Navarro and Flores, 1997. PNAS USA 94:11262-7; Di Serio et al., 1997. J Virol. 71: 6603-10). La possibilità di integrazione di tali esperienze con quella dei colleghi cinesi consentirebbe di caratterizzare in tempi relativamente brevi un sistema biologico di grande interesse scientifico e di notevole importanze economica per la bachicoltura.
 

Obiettivi della ricerca

Mediante lo scambio di materiali, informazioni ed esperienze gli studiosi italiani e cinesi si pongono l’obiettivo di realizzare lo studio esaustivo delle proprietà biomolecolari dell’RNA circolare Mmd-v RNA1 isolato da piante di gelso in Cina. Pertanto ci si propone di:
i) stabilire la natura viroidale ed il convolgimento nell’induzione della malattia di Mmd-vRNA1 mediante esperimenti di trasmissione di Mmd-v RNA1; si verificherà la replicazione autonoma di Mmd-v RNA1 e la correlazione con l’espressione dei sintomi;
ii) escludere la presenza di virus ausiliari nei tessuti sintomatici mediante analisi di  RNA bicatenari di elevato peso molecolare (dsRNAs), generalmente associati ad una infezione virale; l’assenza di dsRNAs è compatibile con la natura viroidale dell’RNA;
 iii) identificare nuovi domini funzionali in Mmd-v RNA1 mediante l’analisi della variabilità di sequenza in diversi isolati della malattia;
iii) determinare il meccanismo di replicazione di Mmd-v RNA1 verificando l’esistenza ed i livelli di accumulo delle molecole circolari di entrambe le polarità nei tessuti sintomatici;
iv) stabilire le proprietà autocatalitiche della polarità positiva e negativa di Mmv-d RNA1 mediante trascrizione in vitro e, se necessario, utilizzando nucleotidi marcati radioattivamente. 
 
 

Ultimo aggiornamento: 09/12/2024