Istituto per l'endocrinologia e l'oncologia "Gaetano Salvatore" (IEOS)

Attività di ricerca

1) Meccanismi molecolari della trasformazione neoplastica

I tumori della tiroide rappresentano la neoplasia più frequente del sistema endocrino. Tuttavia, le basi genetiche della loro origine sono ancora sconosciute. I tumori della tiroide includono adenomi benigni, microcarcinomi (carcinomi "occulti"), carcinomi differenziati (carcinomi papilliferi e follicolari), carcinomi poco differenziati (carcinomi insulari) e carcinomi indifferenziati (carcinomi anaplastici). Abbiamo precedentemente dimostrato che in una percentuale significativa (circa il 40% dei casi) di carcinomi papilliferi della tiroide, il gene RET, codificante per un recettore tirosino-chinasi per fattori di crescita della famiglia del GDNF, presenta dei riarrangiamenti che ne attivano il potenziale oncogeno. Questi riarrangiamenti causano la fusione di RET con diversi geni generando degli oncogeni chimerici definiti RET-PTC (i più frequenti dei quali sono RET-PTC1 e 3). Modelli animali e modelli in vitro hanno dimostrato che RET-PTC é effettivamente in grado di trasformare in senso neoplastico cellule di tiroide e di causare carcinomi papilliferi tiroidei. Questi risultati indicano che RET-PTC é un ottimo marcatore dei carcinomi papilliferi della tiroide (essendo assente in altre neoplasie della tiroide ed in neoplasie non-tiroidee) e ne fanno un ideale bersaglio per approcci di terapia innovativa del carcinoma tiroideo. Recentemente, abbiamo trasfettato RET/PTC nelle cellule tiroidee differenziate di ratto PC Cl3 ed abbiamo osservato che l'espressione di RET/PTC induce, in queste cellule, trasformazione morfologica, perdita delle caratteristiche dello stato differenziato e proliferazione ormono-indipendente. Quindi, allo scopo di analizzare la risposta trascrizionale all'attività di RET/PTC nelle cellule PC Cl3, abbiamo studiato, mediante la tecnologia del "DNA oligonucleotide microarray", il profilo di espressione genica delle cellule PC Cl3 trasfettate con l'oncogene RET/PTC3 o con forme mutate dello stesso, correlando i cambi dell'espressione genica con il potenziale trasformante di RET/PTC3. In questo modo abbiamo identificato diversi geni, appartenenti a classi di molecole coinvolte nella crescita cellulare, nell'apoptosi, nel riparo del DNA, ecc., i cui profili di espressione cambiano tra le cellule trasfettate con RET/PTC3 e quelle trasfettate con le forme mutate. Esperimenti sono attualmente in corso per chiarire il ruolo di questi geni in seguito all'attività dell'oncogene RET/PTC.
Allo scopo di realizzare nuovi strumenti diagnostici in grado di identificare specificamente l'espressione dell'oncogene RET nei tumori tiroidei e di bloccare il signalling di RET nelle cellule neoplastiche, abbiamo preparato anticorpi monoclonali specifici diretti specificamente contro la regione extra-cellulare di RET. Questi anticorpi sono capaci di riconoscere RET espresso sulle cellule neoplastiche, di inibirne la fosforilazione in maniera dose- e tempo-dipendente e di indurne una diminuzione dell'espressione. Inoltre, abbiamo identificato alcuni composti, due pirazolo-pirimidine, PP1 e PP2, e un'anilino-chinazolina, ZD6474, con capacita' inibitoria molto efficiente (IC50: 80nM) nei confronti della chinasi RET. Queste osservazioni lasciano ben sperare per la messa a punto di nuovi farmaci nei contronti dei tumori RET-positivi. Abbiamo anche osservato che il gene H4(D10S170) è frequentemente riarrangiato con l'oncogene RET nei carcinomi papilliferi della tiroide. H4
(D10S170) è dotato di attività pro-apoptotica, per cui quando è iper-espresso nelle cellule foliicolari della tiroide induce apoptosi. La forma troncata di questo gene, invece, svolge il ruolo di dominante negativo sull'attività pro-apoptotica di H4(D10S170) wild-type.
Abbiamo analizzato il ruolo delle proteine HMGA nello sviluppo embrionale e nella trasformazione neoplastica in modelli animali. A tale scopo, abbiamo generato e caratterizzato topi knock-out per il gene PATZ, la cui attività è correlata alle proteine HMGA ed abbiamo analizzato il ruolo di queste proteine nello sviluppo dei tumori dell'ipofisi. Infine, abbiamo dimostrato, insieme ad altri laboratori, che la proteina p27kip1, un inibitore di chinasi ciclino-dipendenti, è inattivata attraverso diversi meccanismi in vari tipi di tumori. I nostri studi hanno evidenziato che la p27kip1 citoplasmatica è meno attiva di quella nucleare come inibitore della crescita e che la chinasi Akt , fosforilando p27kip1, ne determina l'accumulo nel citoplasma impedendone la migrazione nel nucleo. Questo processo impedisce a p27kip1 di effettuare il controllo sul ciclo cellulare e, quindi, le cellule tumorali acquisiscono un vantaggio nella crescita e accumulano varie mutazioni che favoriscono l'instabilità genomica.
Un altro aspetto della nostra ricerca si occupa dello studio della trasduzione del segnale indotta dai recettori tirosino-chinasi (RTK) per lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche nel campo della medicina dei tumori. Grazie alla tecnologia SELEX, abbiamo ottenuto attameri molecolari che agiscono come ligandi biologicamente attivi del recettore RET. Queste molecole rappresentano strumenti innovativi per l'imaging in vivo dei tumori.
Sono stati effettuati studi sulla funzione e la regolazione del recettore dell'urochinasi (uPAR) e del recettore della laminina (67LR), entrambi coinvolti nei processi di invasività e metastasi delle cellule tumorali. Abbiamo dimostrato che il cleavage dell'uPAR regola la sua interazione con le integrine e con il recettore della chemiotassi FPR e che il 67LR è espresso solo nei carcinomi follicolari della tiroide ed è iper-espresso in una classe di leucemie mieloidi acute con morfologia monocitica o mielomonocitica. Inoltre, abbiamo riportato che l'urochinasi regola l'espressione del suo recettore mediante un meccanismo post-trascrizionale nel carcinoma del polmone non a piccole cellule (NSCLC).
Recentemente, abbiamo evidenziato che la proteina Pyk2, una tirosino-chinasi citoplasmatica ricca in residui di prolina, è espressa nelle cellule prostatiche umane normali di origine epiteliale e non in quelle di origine stromale. Inoltre, l'espressione di Pyk2 correla in modo inverso con l'acquisizione del fenotipo trasformato delle cellule prostatiche. Per tale motivo, riteniamo che Pyk2 si comporti come un gene onco-soppressore nelle cellule della prostata e che probabilmente possa svolgere un ruolo chiave nei processi di crescita e differenziamento della ghiandola prostatica.
Abbiamo, infine, studiato i meccanismi attraverso i quali la proteina MENIN, un oncosoppressore, interferisce con la trasformazione cellulare Ras-dipendente.

2) Patologia molecolare delle endocrinopatie

Recentemente abbiamo identificato PED, come un gene sovraespresso nei tessuti periferici di individui con diabete di tipo 2. La sovraespressione di PED in cellule muscolari scheletriche ed adipose genera resistenza all' azione insulinica sul trasporto del glucosio. Pertanto, allo scopo di indagare la rilevanza di PED nel controllo della tolleranza al glucosio nel diabete di tipo 2, abbiamo generato dei topi transgenici sovraesprimenti PED. Il transgene viene espresso nella maggior parte dei tessuti, incluso il pancreas. I topi transgenici, pur non essendo francamente diabetici, presentano livelli di glicemia a digiuno significativamente più alti rispetto ai topi di controllo. Inoltre, i topi PED presentano una ridotta tolleranza al glucosio, misurata mediante esperimenti di GTT (Glucose Tolerance Test). Dunque, in vivo, la sovraespressione di PED altera la tolleranza al glucosio. Inoltre, abbiamo progettato un protocollo per l'identificazione e la quantificazione di PED in campioni ematici di pazienti con diabete di tipo 2. Un altro aspetto della nostra ricerca si occupa dello studio di geni in grado di attivare NF-kB, un fattore di trascrizione coinvolto in numerosi processi, quali l'infiammazione, le infezioni batteriche e virali, il cancro. Recentemente abbiamo isolato un nuovo gene, chiamato CIKS, capace di attivare NF-kB. L'mRNA di CIKS è espresso in maniera ubiquitaria, sebbene a diversi livelli nei vari tessuti, e codifica per una proteina di 576 aa. Sono state identificate due isoforme dell'mRNA di CIKS, che differiscono per una delezione di 27 bp dovuta ad un evento di splicing alternativo. L'isoforma più lunga, che codifica per la proteina wild-type, è meno espressa di quella più corta nelle cellule normali, mentre nelle cellule trasformate questo rapporto si inverte a favore della forma lunga, man mano che le cellule neoplastiche acquisiscono un fenotipo più maligno. Sulla base di questi risultati, lo scopo del nostro progetto è quello di analizzare il ruolo di CIKS nelle cellule umane normali e trasformate. A tale scopo, abbiamo identificato la regione del promotore di CIKS ed i fattori che sono coinvolti nella regolazione della sua espressione, quali il TNF-alfa, l'IL-beta e il TGF-alfa. Inoltre, poiché è noto che NF-kB è costitutivamente attivato nelle cellule derivate da linfomi di Hodgkin, abbiamo studiato l'espressione di CIKS in linee cellulari derivate da linfomi di Hodgkin ed in biopsie di pazienti con linfoma di Hodgkin: CIKS è espresso in due delle cinque linee cellulari analizzate ed in tutte le biopsie, sebbene a diversi livelli.
Inotre, poiché l'attività trascrizionale di NF-kB sembra essere particolarmente elevata anche nelle cellule tiroidee trasformate, abbiamo analizzato l'espressione di GADD45beta, un gene sotto il controllo dell'attività trascrizionale di NF-kB, in cellule tiroidee umane normali e trasformate. I dati ottenuti mostrano che l'espressione di GADD45beta correla con l'attività di NF-kB nelle cellule analizzate.
Sono stati effettuati studi sul ruolo della leptina nella patogenesi del diabete autoimmune di tipo 1, nell'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) e nella sclerosi multipla (MS). Abbiamo così evidenziato che la leptina accelera l'insorgenza del diabete autoimmune nelle femmine dei topi NOD, è in grado di indurre l'EAE in un modello sperimentale animale di sclerosi multipla (MS) ed è capace di ristabilire l'appropriato rapporto cellule T CD4+/CD8+, la risposta proliferativa e la produzione di citochine nei soggetti carenti di tale ormone. Infine, nell'uomo abbiamo osservato un aumento dei livelli di leptina nel siero e nel liquido peritoneale di donne affette da endometriosi pelvica. Dopo una analisi più approfondita abbiamo appurato che la leptina aumenta in donne con endometriosi pelvica e non ovarica, suggerendo una diversa origine patogenetica delle due forme cliniche, precedentemente considerate stadi diversi della stessa patologia. Inoltre, negli ultimi anni abbiamo studiato i meccanismi di proliferazione e differenziamento delle cellule neuro-epiteliali, analizzando il ruolo dell'attivazione cronica di ERK nelle cellule PC12, che rende tali cellule non più responsive al blocco proliferativo NGF-dipendente, e i meccanismi coinvolti nell'induzione dello stato differenziato delle cellule A1 mes c-myc, che ha un profondo impatto sull'attivazione delle cellule T in modelli in vitro ed in vivo di EAE.

3) Differenziamento cellulare e genetica delle malattie ereditarie

L'atassia di Friedreich è la più comune forma di atassia ereditaria autosomica recessiva. Essa è una malattia degenerativa che coinvolge il sistema nervoso centrale e periferico e il cuore. Il gene la cui alterazione è responsabile della malattia (chiamato X25) codifica per una proteina di 210 amminoacidi chiamata frataxina, espressa a differenti livelli in tutti i tessuti. La maggior parte dei pazienti è omozigote per una larga espansione di trinucleotide nel primo introne del gene. La presenza della mutazione causa una severa riduzione del trascritto di X25 e della proteina. Il nostro lavoro si è focalizzato sulla identificazione di geni differenzialmente espressi il una linea di cellule di feocromocitoma di ratto iperesprimenti frataxina. Esperimenti di "differential display" ci hanno portato all'identificazione di un gene delle vie dello stress, la Mitogen activated protein kinase kinase 4 (MKK4). I nostri dati mostrano che MKK4 è negativamente regolata nel sistema di PC12 iperespimenti frataxina ed è positivamente regolata nella ipoespressione in vivo. Siamo inoltre interessati allo studio della genetica delle atassie ereditarie e di altre malattie neurodegenerative e al ruolo patogenetico dello stress ossidativo nella paraplegia spastica ereditaria (HSP), un gruppo geneticamente eterogeneo di malattie neurodegenerative.
Un altro aspetto della nostra ricerca è basato sullo studio dei meccanismi molecolari coinvolti nella regolazione trascrizionale dei geni espressi specificamente nelle cellule tiroidee. In particolare, stiamo studiando i fattori di trascrizione appartenenti alla famiglia dei geni omeotici e dei geni Pax, che sono espressi in tiroide. Abbiamo dimostrato che due di questi fattori interagiscono sia biochimicamente che funzionalmente ed abbiamo effettuato un'estensiva caratterizzazione della loro interazione e dell'effetto trascrizionale promotore-specifico. Inoltre, siamo interessati all'identificazione delle sequenze regolatorie responsabili dell'espressione di Pax8 nelle cellule tiroidee. Risultati preliminari indicano che il TSH regola sia l'espressione di Pax8 che la sua abilità di attivare la trascrizione genica e che questa regolazione è controllata da un meccanismo cAMP-dipendente.
Sono stati effettuati studi sulla caratterizzazione del complesso molecolare responsabile dello smistamento polarizzato di proteine secretorie regolate nelle cellule epiteliali. Recentemente, abbiamo allestito un sistema modello costituito dall'espressione stabile della proteina VGF nelle cellule epiteliali polarizzate FRT e MDCK. In vari tipi cellulari questa proteina è processata in un compartimento post-Golgi, è inglobata in vescicole a nucleo denso e segue una via secretoria regolata. Abbiamo dimostrato che quando VGF è espressa nelle cellule epiteliali polarizzate FRT e MDCK essa è indirizzata nei granuli secretori ed è secreta in direzione apicale: per questo motivo, VGF rappresenta un modello unico per studiare i meccanismi dello smistamento polarizzato di proteine secretorie regolate.