FISR2020 IP_03583 - ViRAL: a Flexible High-Throughput Screen Strategy to Expedite Drug Discovery against RNA-Viruses (DSB.AD006.327)

Area tematica

Scienze biomediche

Area progettuale

Struttura responsabile del progetto di ricerca

Istituto di biologia e patologia molecolari (IBPM)

Responsabile di progetto

CORINNA GIORGI
Telefono: 0649933873
E-mail: corin72@gmail.com

Abstract

La mancanza di farmaci contro SARS-CoV-2 contribuisce allo sviluppo drammatico dell'attuale pandemia. Sarà sviluppato un nuovo saggio cellulare di bioluminescenza, flessibile, sensibile e che potrebbe accelerare la scoperta di farmaci antivirali. Il Viral RNA-Anchored Luminescent assay (ViRAL) che intendiamo sviluppare è ideato per restituire una misura diretta della carica virale mediante bioluminescenza, adattabile ai virus a RNA emergenti o geneticamente instabili. Il saggio sfrutta un sistema quantitativo di complementazione di split-luciferasi in cui la ricostituzione della Luciferasi è mediata dalla presenza dell'RNA virale nelle cellule. Ingegnerizzando interazioni RNA-proteina ben caratterizzate (CRISPR-Cas e MCP-MBS), i frammenti di split-luciferasi vengono ancorati a siti target adiacenti sull'RNA virale, in modo che la ricostituzione della luciferasi dia una misura quantitativa e diretta del carico di RNA virale all'interno delle cellule. Ne prevediamo l'implementazione in indagini high-throughput per lo screening di collezioni di piccole molecole (NCE, new chemical entities), di farmaci approvati dalla FDA, di shRNA o di librerie di anticorpi/nanobodies ricombinanti.

Obiettivi

Gli obiettivi principali del progetto sono:
1. Generare una linea cellulare (Vero E6) che esprime stabilmente due proteine di fusione. Queste consistono di frazioni della split-luciferasi fuse in frame con LwCas13a, capace di legare gli RNA guida CRISPR, ed MCP, un peptide con elevata affinità per l'RNA MS2.
2. Generare un vettore lentivirale che esprime due RNA guida (gRNA): 1) un CRISPR gRNA complementare ad un segmento dell'RNA virale di interesse, così da ancorarvi la proteina di fusione LwCas13a-Split-Luc; 2) Un MS2 gRNA complementare ad una sequenza adiacente dell'RNA virale che ancori la proteina di fusione MCP-Split-Luc.
3. Complementare la linea cellulare stabile con il vettore esprimente i gRNAs, ottenendo così il saggio cellulare ViRAL, di cui testeremo l'efficacia e la sensibilità nel generare una misura quantitativa e specifica di dell'infezione virale.

Data inizio attività

01/11/2021

Parole chiave

screening farmaci antivirali, saggio cellulare, split-luciferasi

Ultimo aggiornamento: 18/04/2024