Attività di ricerca

I progetti di ricerca sviluppati presso la Sezione di Biostrutture riguardano principalmente il design, la sintesi, l'espressione e la caratterizzazione strutturale in soluzione e allo stato solido di molecole di interesse biologico da sistemi peptidici a proteine. In particolare, presso il Centro sono in corso di sviluppo le seguenti tematiche: Design su basi strutturali di nuovi sistemi con potenziali applicazioni nelle biologie avanzate e nell'imaging.
Design su basi strutturali e caratterizzazione di nuovi sistemi con applicazioni in campo diagnostico e terapeutico e di nuovi farmaci con tecniche di diffrazione raggi-x, di risonanza magnetica nucleare e di dinamica molecolare. Studio delle interazioni in sistemi complessi proteina/proteina, proteina/DNA, Proteina/substrato Sintesi su basi strutturali e caratterizzazione con tecniche di diffrazione raggi-x e di risonanza magnetica nucleare di sistemi peptidici e peptidomimetici a diversa complessità.Espressione di sistemi proteici
Queste tematiche di ricerca sono state sviluppate utilizzando varie tecniche sperimentali quali la sintesi peptidica in soluzione e in fase solida, l'espressione di proteine naturali e mutanti, la caratterizzazione strutturale tramite tecniche di Dicroismo Circolare, UV, IR, NMR e Cristallografia. Parallelamente, sono state applicati metodi di predizione teorica e di calcolo al design di nuove molecole, capaci di riprodurre l'attività di una proteina, che possono trovare numerose applicazioni nel campo delle biotecnologie, della farmacologia, della biochimica e della biologia molecolare.
Inoltre presso La Sezione sono in corso progetti di ricerca per la messa a punto di complessi macromolecolari costituiti da varie unità molecolari che, mediante riconoscimento molecolare reciproco, si autoassemblano e sono inoltre capaci di legarsi selettivamente a recettori cellulari. Questi sistemi dovrebbero trovare sviluppo come diagnostici clinici nel settore della medicina nucleare e nella diagnostica per imaging. Infine sono da ricordare le ricerche nell'ambito della regolazione di fattori di trascrizione riportate anche nei focus del REPORT CNR 2002. La necessità di interazioni proteina-DNA per il controllo dell'espressione genica è fortemente sostenuta dalla scoperta che DNA a doppio filamento possono essere usati per alterare la trascrizione dei geni attraverso un approccio decoy. Gli acidi peptido-nucleici (PNA) sono stati recentemente proposti come reagenti alternativi in esperimenti finalizzati al controllo dell'espressione genica. Queste molecole ibridizzano con alta affinità sequenze complementari di rna e DNA a singolo filamento, formando doppie eliche di tipo Watson Crick. Fino ad ora sono disponibili poche informazioni sul possibile uso di PNA come molecole decoy. Gli effetti biologici dei PNA potrebbero rivelarsi in una significativa riduzione e/o nel blocco delle interazioni dei fattori di trascrizione con le sequenze promoter target, portando ad una possibile strategia per la modulazione artificiale dell'espressione genica. Per poter essere utilizzati in applicazioni in vivo, gli oligonucleotidi decoy devono mantenere una conformazione tridimensionale tale da legare specificamente e con la più alta affinità possibile il target molecolare, devono avere una ragionevole stabilità nell'intorno fisiologico (o patologico) di interesse e devono essere facilmente sintetizzati in quantità sufficienti per l'uso clinico. Un modo appropriato per soddisfare i requisiti imposti nei punti precedenti è quello di progettare molecole costituite da blocchi di diversa natura chimica legati covalentemente. Lo scopo è quello di ottenere una molecola con buone proprietà di trasporto ed elevata stabilità alla degradazione enzimatica. Noi abbiamo raggiunto questo scopo sintetizzando sistemi chimerici, in cui un filamento è costituito dal coniugato PNA-5'DNA3'-PNA e il complementare da PNA-5'DNA3'-PNA. Il PNA ha la funzione di migliore la resistenza alle nucleasi e contemporaneamente la stabilità della doppia elica. Lo scopo principale del lavoro condotto nel 2001 in quest'ambito è stato quello di determinare se chimere PNA-DNA mimanti i siti di binding del fattore nucleare kB (NF-kB) sono capaci di interazioni stabili con NFkB p52/p50 e con fattori nucleari da cellule limfoidi-B. Il disegno delle chimere PNA-DNA per NF-Kb fu eseguito con l'utilizzo anche di tecniche di dinamica molecolare per prevedere l'interazione con le proteine nucleari della famiglia dell'NF-kB.
Le interazioni tra la chimera PNA-DNA e le proteine NF-kB sono state studiate con saggi elettroforetici di "mobility shift". Inoltre, abbiamo dimostrato che, ibridi tra DNA e chimere DNA-PNA e doppi filamenti chimerici mimanti i siti di legame di hiv-1 NF-kB, sono in grado di sopprimere le interazioni molecolari tra hiv-1 ltr e p50, p52 e fattori nucleari da cellule limfoidi B. I risultati ottenuti chiaramente dimostrano che le chimere disegnate possono essere proposte come potenti molecole decoy in terapia genica.


L'attività di ricerca della Sezione di Bioimmagini ha riguardato specifici progetti di ricerca che per la maggior parte possono essere inquadrate nelle seguenti aree:
Oncologia sperimentale e diagnostica clinica - Cardiologia - imaging vascolare
Neuroimaging - Image processing
Radioterapia - Radioprotezione
TC/RM body -RadiodiagnosticaoMedicina Nucleare RXT met MOC
Attività specifiche del settore oncologico riguardano:
Individuazione in vivo e iperespressione del Bcl-2 nel Cancro Caratterizzazione morfofunzionale di neoplasie solide e linfoproliferative nella diagnosi e predittività alla risposta Stabilità in plasma e binding su linee cellulari di ligandi per i recettori della colecistochinina. Valutazione pre-clinica.
Meccanismi multipli di farmacoresistenza in tumori solidi umani.
Sviluppo di nuove strategie di controllo della progressione tumorale e dell'invasività del carcinoma della mammella Angiogenesi Timoma e immunopatie: Diagnostica per immagini e terapia
Caratterizzazione integrata del mieloma multiplo per inquadramento diagnostico e prognostico
Studio sperimentale dei modificatori delle risposte biologiche alla radioterapia Caratterizzazione dei tumori epatici mediante RM: confronto con TC
Tomografia Computerizzata multisezione nelle neoplasie pancreatiche
Attività specifiche nel settore dell'imaging cardiologico hanno incluso:
Studi di captazione di Tc-99m tetrofosmina e PET-FDG dopo nitrati Valutazione prognostica a lungo termine in pazienti con cardiopatia ischemica e disfunzione ventricolare sinistra con: SPECT e PET
Valutazione prognostica a lungo termine dopo rivascolarizzazione di "miocardio vitale disfunzionante " determinata con MIBI:
Valutazione prognostica di riserva coronarica con MIBI SPECT nel miocardio " stunned, hibernating and scarredQ"
Attività specifiche nelle aree neuroimmagini e elaborazione delle immagini includono: la collaborazione a un progetto strutturale finanziato dal MIUR per la installazione di impianti di imaging a alta tecnologia ; la messa a punto di una procedura di correzione e eliminazione degli effetti di volume parziale nelle immagini di tomografia emissiva, nell'ambito di un progetto finanziato dal V PQ di cui l'IBB ha la responsabilità di coordinamento (vedi attività di ricerca PVEOut):
attività di ricerca nel settore dell'imaging RM quantitativo delle malattie neurodegenerative, in particolare per lo studio della malattia di Alzhemer, della malattia di Parkinson, della sclerosi multipla, della Sclerosi laterale amiotrofica e delle vasculopatie ischemiche cerebrali; imaging recettoriale delle malattie neurodegenerative (malattie di Alzheimer, SLA e Parkinson)
A queste aree di interesse si aggiungono:
le attività di ricercatori associati alla sezione che svolgono di ricerca nei settori della biometria e della oncoematologia; lo sviluppo di un progetto collaborativi di telemedicina; progetti collaborativi per lo studio delle patologie vascolari addominali(in particolare del rene) e delle patologie vascolari degli arti; progetti collaborativi nell'ambito della sicurezza (Metodologia di valutazione e riduzione del rischio in presenza di sorgenti a radiofrequenze e microonde negli ambienti di ricerca nelle applicazioni domestiche)

L'IBB-Ct persegue obiettivi di ricerca che possono essere così riassunti:
Progettazione e caratterizzazione di nuove molecole di natura peptidica per lo studio del processo di "misfolding" di proteine amiloidogeniche come la proteina prionica (PrP), l'amilina (nota anche come IAPP), il b-amiloide nonchè l'interazione di tali proteine con molecole antifibrillogeniche.
Progettazione e sintesi di ciclodestrine bioconiugate con carnosina, omocarnosina, carcinina, farmaci anti-infiammatori non steroidei (FANS), porfirine e peptidi con attività antiaggregante, antiossidante e chelante nei confronti di ioni metallici.
Per quanto concerne il primo punto, l'IBB-Ct possiede un'adeguata competenza che scaturisce da un decennio di lavoro sperimentale basato sulla sintesi, sulla caratterizzazione e studio della complessazione di ioni metallici da parte di oligopeptidi appartenenti a domini di metallo proteine di cui è nota la struttura e la funzionalità. Nell'ambito della ricerca relativa ad i sistemi peptidici, si è partiti con la sintesi e la caratterizzazione spettroscopica e termodinamica dei complessi del rame (II) e zinco (II) con dipeptidi lineari e ciclici. Questi studi hanno permesso di valutare il ruolo giocato dalle interazioni idrofobiche nella stereoselettività e stabilizzazione dei complessi con ioni metallici.
Successivamente, sono stati impiegati approcci sperimentali simili per lo studio di sistemi peptidici di maggiori dimensioni contenenti residui istidinici, progettati per ottenere complessi con il Cu(II) da impiegare come modelli dell'enzima SOD. E' da rilevare che da questi studi sono state ottenute utili informazioni relative al meccanismo attraverso cui questi complessi esplicano la loro attività SOD-like e le relazioni esistenti tra l'attività misurata e le proprietà strutturali dei complessi.
La complessazione con gli ioni metallici è stata inoltre impiegata per ottenere il folding di peptidi sintetici in conformazioni ben definite.
In questo caso l'introduzione di siti di legame per gli ioni metallici in oligopeptidi appropriatamente progettatii risulta essere di notevole aiuto per il controllo della conformazione ed il self-assembly di strutture peptidiche e rappresenta un approccio promettente per mimare siti attivi di metallo proteine in peptidi di natura sintetica.
Recentemente, gli interessi di ricerca sono stati focalizzati sullo studio delle relazioni che intercorrono tra malattie neurodegenerative, come Alzheimer e malattie da prioni, e metalli di transizione. Queste patologie, classificate tra le malattie correlate al misfolding di proteine, sono state attribuite ad alterate interazioni metallo-proteina con conseguenti danni e formazione di aggregati. Attualmente, stiamo studiando la formazione di complessi tra Cu(II) e sequenze peptidiche omologhe alle ottaripetizioni trovate nel dominio N-terminale del prione umano umano (PrP) e sui frammenti PrP (106-126 e 180-193) della stessa proteina. Sono in corso studi che hanno lo scopo di acquisire il maggior numero di informazioni sulle possibili modalità di legarsi dello ione Cu(II). Tutto ciò scaturisce dal fatto che un coinvolgimento dello ione rame (II) nella patogenesi delle malattie da prione non può essere escluso. Tali studi potrebbero contribuire a risolvere le contraddizioni presenti in letteratura relativi alla stechiometria, alla stabilità ed alla individuazione dei siti di legame per gli ioni metallici nonché alla struttura dei complessi rame(II)-proteina.
Studi recenti hanno messo in evidenza che l'alterazione dell'omeostasi degli ioni metallici nel cervello sia responsabile del danno neuronale osservato nelle malattie di Azheimer e nelle encefalopatie di origine prionica. Tuttora risulta ancora incerto l'esatto meccanismo della patogenesi ma è stato ipotizzato che lo stress ossidativo giochi un ruolo fondamentale. Quindi l'uso di composti antiossidanti, soprattutto quelli che hanno la capacità di oltrepassare la barriera emato-encefalica,
dovrebbero essere di immediata rilevanza per il trattamento di malattie neurodegenerative. Stiamo sviluppando la sintesi di derivati ciclodestrinici (b-CD) contenenti una serie di unità farmacologicamente attive; tra di esse il dipeptide carnosina è stato riportato essere un farmaco protettivo contro lo stress ossidativo.
I derivati ciclodestrinici coniugati con carnosina non vengono degradati dall'enzima carnosinasi mantenendo però intatta la attività biologica della carnosina. Inoltre, abbiamo recentemente dimostrato che la b-CD tal quale risulta essere un efficiente scavenger per l'OH×. Poichè studi recenti hanno mostrato come le b-CD posseggano attività anti-fibrillogenica nei confronti del peptide Amiloide b, potrebbe essere possibile ottenere composti bioconiugati in grado di avere capacità di chelare ioni metallici e allo stesso tempo avere attività antiossidante ed antiamiloidogenica. In questo stesso contesto la coniugazione di composti antiossidanti con lo zucchero a basso peso molecolare trelosio potrebbero raggiungere l'obiettivo di produrre farmaci antiossidanti in grado di oltrepassare la barriera emato-encefalica.
Infine, abbiamo legato covalentemente alcuni farmaci anti-infiammatori alla b-CD per potere conferire a questi nuovi composti coniugati proprieta fisico- e bio-farmaceutiche completamente differenti da quelle possedute dai farmaci non derivatizzati.
In relazione all'ultimo punto, si può notare come la complessazione della b-CD riduca alcuni effetti collaterali indesiderati come dispesia, ulcere gastrointestinali e nefrotossicità di alcuni farmaci FANS. Le b-CD risultano essere solo leggermente assorbite durante il loro passaggio attraverso lo stomaco; però esse vengono fermentate dalla flora batterica del colon in zuccheri a basso peso molecolare ed in questa forma possono essere assorbiti dall'intestino. Questa proprietà di biodegradazione delle b-CD fa sì che questi coniugati ciclodestrinici siano di particolare utilità nel trasporto sito-specifco di farmaci nel colon. Quest'ultimo aspetto riveste un particolare interesse nel in relazione all'attività chemiopreventiva esplicata da diversi farmaci FANS sulla carcinogenesi del colon.