E' ipotesi comune che la sclerosi multipla (SM) sia una malattia complessa di origine immunologica dovuta all'interazione di diversi geni. Nello sforzo comune di chiarire e contribuire informazioni associate alla SM abbiamo identificato una famiglia di origine tedesca vivente nello stato della Pennsylvania (USA) segregante SM secondo un modello autosomico dominante. Abbiamo collezionato campioni di sangue provenienti da 18 membri della famiglia dei quali 7 mostrano i tipici segni di SM. I 18 membri sono stati sierotipizzati per le classi I e II HLA e sono stati analizzati i microsatelliti dell'intero genoma umano alla ricerca di nuovi marcatori in linkage con la malattia. Dalla nostra analisi ci sono evidenze di un locus genomico sul cromosoma 12p12 con valore massimo di lod-score di 2.71 in presenza dell'allele DR15,DQ6.(Vitale E., Cook S., Sun Specchia C., Subramanian K., Rocchi M., Nathanson D., Schwalb M., Devoto M., and Rohowsky-Kochlan C. Linkage analysis conditional on HLA status in a large North American pedigree supports the presence of a multiple sclerosis susceptibility locus on chromosome 12p12. Human Mol Genetics 2002 3:295-300). In parallelo studi indipendenti sul modello animale di SM, il topo CREAE, hanno dimostrato un effetto benefico mediato dai recettori dei cannabinoidi sulla spasticità della SM (Di Marzo V, Bisogno T, De Petrocellis L. Expert Opin Ther Targets. 2001; 5:349-362; Di Marzo V, Bifulco M, De Petrocellis L. Trends Pharmacol Sci. 2000; 21:195-197). Questo focus è basato quindi sui dati ottenuti dall'analisi molecolare dei campioni provenienti da questa famiglia segregante SM. I nostri obiettivi sono: definire la regione genomica 12p12 e identificare geni coinvolti nella SM. Inoltre in uno studio parallelo verranno utilizzati topi CREAE per studiare i profili di espressione nel modello animale. Obiettivo 1. Caratterizzazione genica della regione genomica 12p12 utilizzando le informazioni presenti nei diversi databases e caratterizzando tutte le sequenze a funzione ancora sconosciuta che potrebbero essere coinvolte con SM. Obiettivo 2. Analisi dell'espressione genica utilizzando la tecnologia di microarrays. Arrays di oligonucleotidi commercialmente disponibili (Affimetrix)sono rappresentati da vetrini contenenti informazione su 12.000 geni. L'informazione è sotto forma di oligomeri composti da 25 basi. L'RNA estratto da due diverse fonti (per esempio: linfociti provenienti da individuo controllo normale e affetto), viene retrotrascritto in cDNA contenente il promotore T7-RNA polymerase. I prodotti di amplificazione vengono ulteriormente amplificati e marcati con biotina in una reazione di trascrizione in vitro. I cRNA così prodotti sono poi usati per ibridare gli oligo-array. La quantizzazione dell'incorporato dà la misura del profilo di espressione e viene fatta usando specifici scanners che determinano la quantità di geni attivati e non, tra i 12.000 presenti sul vetrino. Alternativamente si usano oligonucleotidi arrays self-printed. Questi arrays con oligonucleotidi di 70 basi e circa 19.000 geni vengono applicati con sofisticati robot su vetrini trattati con polilisina. L'RNA totale viene direttamente marcato durante la reazione di sintesi di oligo dT cDNA con Cy3 o Cy5 e ibridizzato con l'array. Anche in questo caso si valuta l'intensità della fluorescenza ibridizzata come misura della variazione di espressione dei 19.000 geni.
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