09/10/2013
Uno studio pubblicato nella nuova rivista open access ‘eLife’ presenta una innovativa strategia per l’analisi dell’attività proteica in vivo, attraverso l’uso di proteine fluorescenti che riportano i cambiamenti conformazionali a cui molte proteine sono sottoposte durante la loro attività.
Le proteine ‘trasportatrici’ giocano un ruolo critico nell’assorbimento e rilascio di ioni e metaboliti nella cellula, e per la loro distribuzione subcellulare. Data la loro natura idrofobica, la caratterizzazione dei trasportatori è difficoltosa, e le misure delle attività di trasporto tipicamente dipendono dall’uso di molecole radioattive ed espressione in altre specie. Anche le tecniche elettrofisiologiche sono limitate all’analisi di processi a livello della membrana plasmatica, o di cellule sulla superfice di tessuti sezionati. Inoltre, esse non premettono di distinguere tra isoforme di trasportatori o di studiare compartimenti subcellulari. Ad oggi non si era in grado di seguire direttamente l’attività dei trasportatori e studiare la loro regolazione in vivo.
In questo studio si è sviluppato un nuovo strumento biotecnologico per lo studio, in cellule intatte, dell’attività di un trasportatore (in questo caso, diversi membri della famiglia degli trasportatori dell’ammonio). L’ipotesi di partenza era che fosse possibile usare una proteina fluorescente sensibile all’intorno ambientale (quale la green fluorescent protein circolarmente permutata, cpGFP) fusa a un trasportatore di interesse (qui, come modello, diversi membri della famiglia dei trasportatori dell’ammonio AMT) per creare una chimera che legasse l’attività del trasportatore all’emissione in fluorescenza. Si sono creati così una serie di sensori di attività che rappresentano una svolta nelle tecniche di studio dei trasportatori e delle proteine.
Si prevede che tale tecnologia innovativa sia esportabile ad altri trasmettitori (compresi quindi i neurotrasmettitori) e, per estensione, agli enzimi in generale, in quanto sia il ciclo di un trasportatore che quello di un enzima, sia esso solubile o di membrana, prevede quasi invariabilmente dei cambiamenti conformazionali che possono essere visualizzati attraverso la fusione con un fluoroforo sensibile. L’emissione in fluorescenza diventa così un misura conveniente e non invasiva dell’attività di una proteina.
Le ricadute potenziali sono molteplici: dal punto di vista di ricerca di base, la ‘visualizzazione’ diretta di un’attività proteica rappresenta un’assoluta novità e potrebbe rendere accessibile lo studio di tutti quei trasportatori ed enzimi per cui non esistono ad oggi valide alternative elettrofisiologiche, o via uso di substrati radioattivi. Dal punto di vista farmacologico, l’analisi dell’attività proteica attraverso la fluorescenza, da contrapporre a laboriosi saggi enzimatici, radioattivi o elettrofisiologiche, faciliterebbe enormemente lo screening di librerie di molecole per l’identificazione di inibitori e regolatori di attività. Dal punto di vista di biotecnologie ambientali, infine, tali sensori potrebbero essere impiegati in chip per il monitoraggio di metaboliti inquinanti (lo stesso ammonio, che viene misurato dai sensori che ho creato nel mio progetto, si comporta da nutriente a basse concentrazioni e da tossina se presente in eccesso).
Lo studio è il frutto di una collaborazione di Roberto De Michele, ricercatore dell’Istituto di genetica Vegetale del Cnr (Igv-Cnr), con il Department of Plant Biology, Carnegie Institution for Sciences, a Stanford (USA), ed è accessibile liberamente al sito: http://elife.elifesciences.org/content/2/e00800.
Per informazioni: Roberto De Michele, Igv-CnrCorso Calatafimi 414, 90129 Palermo, tel.: 091/6574578, fax: 091/423424, email: roberto.demichele@cnr.it