Analysis of mannitol-producing lactic acid bacteria: a  proteomic approach

Project leaders

Gianluca Picariello, Elvira Maria Hebert

Agreement

ARGENTINA - CONICET - Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas

Call

CNR/CONICET 2011-2012

Department

Agriculture and Food

Thematic area

Biology, agriculture and food sciences

Status of the project

New

Research proposal

Il D-mannitolo è un polialcol che trova numerose applicazioni nel campo alimentare, chimico, medico e farmaceutico. Il maggiore impiego a livello industriale del mannitolo è come additivo alimentare, quale agente dolcificante e testurizzante. Il mannitolo riduce la tendenza degli zuccheri alla cristallizzazione ed è utilizzato come tale per aumentare la shelf-life degli alimenti. La sostituzione del saccarosio o altri zuccheri “tradizionali” con il mannitolo offre diversi vantaggi nella preparazione di molti prodotti alimentari: il mannitolo ha un discreto potere dolcificante, è non-cariogenico, ha un ridotto apporto calorico ed è assorbito parzialmente e molto lentamente a livello intestinale. Grazie a quest’ultima caratteristica, il mannitolo induce una secrezione insulinica più graduale se paragonata al saccarosio ed è quindi un ottimo sostituto di altri dolcificanti nella preparazione di prodotti alimentari destinati ai diabetici. Molti studi hanno dimostrato un’azione da parte del mannitolo nella prevenzione dei danni ossidativi ed una produzione dei lipidi delle membrane cellulari attraverso uno “scavenging” di radicali reattivi dell’ossigeno. Ovviamente l’utilizzo del mannitolo in preparati alimentari è limitato dalle potenziali proprietà lassative ad alte concentrazioni (l’apporto giornaliero non dovrebbe superare i 20 gr). A livello industriale, il mannitolo è prodotto per idrogenazione del fruttosio ad alta pressione ed alta temperatura. Questo processo ha una discreta efficienza e richiede un’elevata purezza del substrato per limitare la presenza di prodotti secondari difficilmente separabili.Dal momento che il mannitolo è un comune metabolita di riserva di molti funghi o lieviti che spesso lo secernono nel mezzo extracellulare, la sua produzione per via fermentativa, nota già da tempo, è una possibile alternativa con miglior rendimento.Anche i batteri possono produrre mannitolo a partire da alcuni substrati. Specialmente i batteri lattici eterofermentanti producono consistenti quantità di mannitolo a partire dal fruttosio. I batteri lattici omofermentanti producono quantità limitate di mannitolo solo quando hanno una ridotta attività lattato deidrogenasica. I meccanismi biochimici alla base della produzione del mannitolo sono ben noti. L’acetilfosfato è normalmente ridotto ad etanolo, in modo da mantenere il bilancio redox in equilibrio. L’organismo è obbligato a convertire l’acetilfosfato ad etanolo in condizioni anaerobiche, con un considerevole dispendio di energia. Se un altro accettore di elettroni, quale il fruttosio, è presente nel mezzo di coltura, il microrganismo usa quest’ultimo come accettore di elettroni. In questo caso il processo comporta un dispendio energetico minore in termini di ATP. L’enzima mannitolo deidrogenasi (MDH) ha un ruolo chiave in questo processo, catalizzando in un unico step la conversione del fruttosio in mannitolo e viceversa. MDH è già stato caratterizzato in diverse specie di batteri lattici; è un enzima cofattore-dipendente e richiede la presenza di NADH2 o NADPH2 quali riducenti. I processi ottimizzati per la produzione di mannitolo riescono a fornire concentrazioni fino a 100-200 g/L nel mezzo di coltura. La produzione del mannitolo è fortemente dipendente dalle condizioni di coltura ed è particolarmente stimolata in condizioni di stress osmotico. La produzione di mannitolo richiede l’utilizzo di fruttosio e questo può rappresentare limitazione dal punto di vista economico. La produzione a partire da altri saccaridi rappresenta una soluzione alternativa che deve ancora essere investigata. L’attività di ricerca proposta nell’ambito dell’accordo bilaterale CNR-CONICET si inquadra in un progetto in cui il CERELA-CONICET è attualmente impegnato. Tale progetto, a carattere multidisciplinare - microbiologico, biochimico e genetico - è finalizzato a) all’ottimizzazione dei processi biosintetici del mannitolo utilizzando ceppi di batteri lattici selezionati e b) ad uno scale-up del processo a livello industriale. L’ingegnerizzazione dei processi metabolici attraverso l’overespressione e/o la delezione di specifiche sequenze geniche codificanti opportune attività enzimatiche è una pratica comune per sviluppare o migliorare le performance dei ceppi di microrganismi selezionati. Tuttavia numerose evidenze sperimentali hanno dimostrato che l’ingegnerizzazione metabolica focalizzata su singoli pathway ha numerose limitazioni. Infatti, la perturbazione dei flussi metabolici porta generalmente a fenotipi non prevedibili “a priori”. La definizione e la mappatura dei flussi metabolici quali parte di un network metabolico non-lineare, realizzate attraverso un approccio “omico” integrato,  è essenziale per conseguire e sviluppare le caratteristiche fenotipiche desiderate per i ceppi ingegnerizzati. Sebbene i ceppi probiotici abbiano abitualmente origine dal tratto gastrointestinale umano, moderne linee di ricerca mirano ad approfondire la possibilità di reperire ceppi lattici probiotici direttamente tra le microflore naturali di alimenti fermentati, non solo lattiero-caseari ma anche di origine vegetale o carnea, allo scopo di selezionare batteri che presentino contemporaneamente favorevoli proprietà tecnologiche e salutistiche. E’ importante sottolineare, in quest’ottica,  che la selezione di batteri lattici produttori di mannitolo quali i  probiotici potrà avere notevoli ricadute anche in termini di progettazione di nuovi alimenti fermentati, ad esempio derivati lattiero-caseari, con proprietà funzionali. Pertanto, un ulteriore obiettivo in prospettiva dell’accordo bilaterale fra ISA-CNR e CERELA-CONICET sarà quello di selezionare ceppi di batteri lattici produttori di mannitolo da utilizzare come probiotici starter nella preparazione di alimenti funzionali.

Research goals

Il CERELA-CONICET è già impegnato in uno progetto dal titolo Produción de edulcorantes naturales por bacterias lácticas. Síntesis de manitol. Obiettivo centrale del progetto è la razionale ottimizzazione dei processi biosintetici del mannitolo in ceppi selezionati di batteri lattici quali Lactobacillus coryniformis subsp. coryniformis CRL 1001 e L. fermentum CRL 573. I modelli metabolici derivati dallo studio “omico” integrato (analisi del genoma depositato e profili trascrittomico e proteomico) saranno utilizzati per sviluppare strategie ottimizzate di produzione industriale di mannitolo. L’obiettivo specifico dell’accordo bilaterale CNR-CONICET sarà quello di definire e monitorare le condizioni di sovra-espressione dell’MDH in funzione delle differenti condizioni di crescita. Un ulteriore obiettivo sarà l’ottenimento di opportuni mutanti con attività alcol/lattato deidrogenasica soppressa in modo da limitare la biosintesi di metaboliti indesiderati. Presso l’ISA-CNR si contribuirà sarà condotta l’analisi proteomica (elettroforesi bidimensionale accoppiata spettrometria di massa, MS) sia dei ceppi produttori di mannitolo che dei relativi mutanti. Infine, saranno eseguiti studi in vitro di “attività probiotica”. Le informazioni ottenute consentiranno anche di selezionare opportuni ceppi di batteri lattici da utilizzare potenzialmente nella produzione di derivati lattiero-caseari (es. latti fermentati) dotati di proprietà probiotiche e funzionali.

Last update: 19/04/2024