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Istituto di genetica molecolare

Attività di ricerca

L'attività dell'Istituto è organizzata in 7 Reparti (Commesse) di cui 5 attive a Pavia e 2 a Bologna. I progetti sono totalmente finanziati da fondi esterni tranne il progetto bandiera Epigen a cui partecipano ricercatori di più commesse. L'insieme delle attività è caratterizzato da una notevole interazione tra gruppi e da una sostanziale omogeneità di interessi con utilizzo di approcci di biologia molecolare e cellulare alle problematiche biologiche più attuali. L'Istituto da sempre è punto di riferimento culturale e organizzativo a livello nazionale ed internazionale per quanto riguarda le ricerche nel campo della genetica, della biologia molecolare e cellulare, e delle relative applicazioni biotecnologiche. Inoltre, grazie al rapporto di stretta interazione con il Dipartimento di Biologia e Biotecnologie dell'Università di Pavia, IGM partecipa alla formazione di giovani.
Di seguito un breve sunto delle attività di ricerca svolte presso IGM.


BERSAGLI MOLECOLARI PER IL CONTROLLO DELLA PROGRESSIONE TUMORALE (Commessa ME.P03.012).
Responsabile: Dott. William Blalock
Questa è una delle due commesse attive a Bologna all’interno dell’Istituto Ortopedico Rizzoli. La ricerca, di tipo interdisciplinare e traslazionale, si propone di sfruttare le competenze del gruppo nei settori 1) della trasduzione di segnali infiammatori (inositide-dipendente e stress mediato) nel nucleo cellulare, 2) della regolazione dei processi apoptotici e di sopravvivenza cellulare. Gli studi si avvalgono di campioni bioptici e cellulari ottenuti da pazienti già classificati da un punto di vista clinico e sottoposti a terapie. Vengono studiati i meccanismi di progressione di malignità e dei potenziali bersagli per una terapia farmacologica di alcune patologie neoplastiche. La ricerca prevede anche di determinare il grado di nocività di radiazioni elettromagnetiche non ionizzanti ed una loro eventuale implicazione nei meccanismi neoplastici.
Obiettivi specifici e sviluppi applicativi sono:
a) definire i meccanismi di regolazione della progressione tumorale che coinvolgono in particolare la trasduzione dei segnali infiammatori/stress. Viene studiato l'interattoma nucleare di PKR in un modello di leucemia acuta per comprendere il ruolo di questa chinasi nella biogenesi ribosomale, divisione cellulare, espressione genica e stabilità di mRNA/RNA "processing".
b) definire l'attività di proteine chinasi e la trasduzione del segnale come bersaglio della terapia anti-tumorale. In questo ambito sono stati vagliati numerosi protocolli di inibizione farmacologica di chinasi e altri enzimi rilevanti in una serie di leucemie.
c) Una linea interessante riguarda la caratterizzazione degli RNA contenuti negli esosomi.
d) Vengono anche condotti studio di matrici per la rigenerazione ossea/dentina e neurogenesi.

SVILUPPO E MECCANISMO D'AZIONE DI ANALOGHI NUCLEOTIDICI E NUCLEOSIDICI COME COMPOSTI ANTIPROLIFERATIVI E ANTIVIRALI: NUOVI COMPOSTI E NUOVI BERSAGLI PER LA TERAPIA (Commessa ME.P04.004)
Responsabile: Dott. Giovanni Maga
Questa Commessa si qualifica come una piattaforma integrata per lo sviluppo e l'applicazione di approcci innovativi in campo biomedico.
La commessa incarna lo spirito della ricerca di tipo traslazionale, in cui la ricerca di base, volta ad acquisire nuove informazioni sui processi biologici di interesse, si fonde con la ricerca applicata, orientata alla traduzione delle conoscenze in campo applicativo. Parte integrante dell'attività della Commessa è la ricerca di sinergie con il settore privato.
L’attività si articola su due linee principali.
1) Identificazione di nuovi bersagli e nuove molecole per sviluppo di farmaci, antivirali, antiprotozoari, antibatterici e anti-tumorali.
Vengono sviluppati inibitori farmacologici contro proteine di interesse biomedico espresse in batteri, o lievito o cellule di insetto. Tra le proteine analizzate i) la tirosina chinasi Hck coinvolta nelle leucemie e nel ciclo vitale di HIV-1, ii) la endonucleasi PA-X del virus dell'Influenza A umano iii) la chinasi cellulare Pim coinvolta nella regolazione del ciclo cellulare; iv) la timidina chinasi erpetica. Vengono anche chiariti con metodi biochimici i meccanismi tramite quali i composti identificati esplicano la loro attività.
Una parte del gruppo si occupa di studiare gli effetti di derivati della berberina sul metabolismo delle cellule tumorali. Nell’ambito della caratterizzazione dell’effetto che il microambiente ha sulle cellule del tumore, in collaborazione con il Dipartimento di Ingegneria, vengono sviluppati dispositivi fotonici per separare cellule con proprietà di motilità, elasticità e forma differenti. Vengono anche identificati biomarcatori di stress cellulare in soggetti esposti a fonti di stress endogene o ambientali (ad esempio Arsenico).
Parte dell’attività si focalizza su argomenti di ricerca di base che costituiscono la base per nuovi studi applicativi. Ad esempio, viene studiato anche il meccanismo di azione della DNA polimerasi lambda, una polimerasi specializzata coinvolta nella riparazione del danno a doppio filamento con il meccanismo del non-homologous end joining. Inoltre viene caratterizzato il coinvolgimento della poli(ADP-ribosilazione) in vari tipi di morte cellulare: apoptosi, autofagia, parthanatos e necroptosi.
2) La seconda linea di ricerca riguarda lo sviluppo di nuove tecniche e metodologie ottiche per biologia di base e pratica clinica. Recentemente questa attività è stata oggetto di interesse da parte di numerose PMI. Vengono a messe a punto metodologie e strumentazioni per applicare l’autofluorescenza cellulare a metodi di biopsia ottica. Questo permette di identificare in tempo diretto le cellule tumorali o monitorare la sofferenza tissutale durante durante le operazioni chirurgiche. La metodica viene utilizzata anche per studiare il differenziamento delle cellule staminali.

MALATTIE GENETICHE DOVUTE A DIFETTI NELLA RIPARAZIONE DEL DNA CHE PREDISPONGONO AI TUMORI. ANALISI GENETICA FUNZIONALE DEI FATTORI IMPORTANTI PER L'INTEGRITÀ DEL GENOMA. (Commessa: ME.P05.005)
Responsabile: Dott.ssa Miria Stefanini
La ricerca si propone di contribuire alla comprensione di alcune patologie ereditarie e di alcuni dei meccanismi che giocano un ruolo fondamentale nel mantenimento della struttura e della funzione del genoma.
Obiettivi specifici sono:
1) Comprensione delle basi patogenetiche e della relazione genotipo-fenotipo nelle malattie ereditarie difettive nella riparazione per excisione di nucleotidi (NER). Vengono condotti esperimenti di RNA-Seq, proteomica e biologia molecolare per identificare nuovi geni per malattie ereditarie difettive nel NER, quali xeroderma pigmentosum (XP), tricotiodistrofia (TTD), sindrome di Cockayne (CS) e UV-sensitive syndrome (UVSS) e chiarire i meccanismi molecolari attraverso cui si esplica la loro funzione. Nell’ambito di questa attività viene anche eseguita la caratterizzazione cellulare, genetica e molecolare di nuovi pazienti. Oltre che di supporto per la diagnosi clinica, la caratterizzazione di nuovi casi permette di arricchire la collezione di linee cellulari con nuove mutazioni in geni del NER. Viene inoltre studiata l’interazione tra il complesso trascrizionale e quello di riparazione in funzione della risposta al danno sul DNA e per chiarire il ruolo di questa interazione nel definire le caratteristiche dei pazienti affetti da difetti di NER.
3) Identificazione di funzioni coinvolte nella trasformazione cellulare e nell'amplificazione genica. Ruolo dei telomeri e della telomerasi nel mantenimento della stabilità del genoma. Grazie all’uso del modello delle tumosfere viene studiato l’effetto della sovra-espressione della telomerasi nella trasformazione neoplastica. Le cellule vengono caratterizzate sia dal punto di vista dei profili di espressione che delle proprietà di staminalità e di tumorigenicità in vivo. In collaborazione con dipartimento di Ingegneria dell’Università di Pavia viene sviluppato un nuovo dispositivo microfluidico per distinguere popolazioni cellulari con diversa capacità migratoria e metastatica e per studiare la risposta a farmaci che interferiscono con l'organizzazione dei microtubuli.
4) Definizione del ruolo di modificazioni post-traduzionali di fattori coinvolti nella riparazione del DNA. Viene studiato il ruolo dell'acetilazione di fattori del NER nella risposta a danni genotossici in particolar modo l’effetto dell’acetilazione sul legame alla cromatina e successiva degradazione proteolitica di PCNA e la rilevanza di questo evento nell’efficienza di riparazione del DNA. In questo ambito viene studiata la sindrome di Rubinstein-Taybi (RSTS), caratterizzata da difetti di espressione di CBP o di p300, due enzimi che acetilano fattori della riparazione del DNA in particolare di quelli coinvolti nel "base excision repair" (BER). Viene anche studiato il ruolo di p21CDKN1A nella regolazione dell'attività di PARP-1 ai siti di danno al DNA.

CROMOSOMI ARTIFICIALI PER TERAPIA GENICA. STUDI SULLA REPLICAZIONE DEL DNA IN CELLULE UMANE; CONTROLLO DEL CICLO CELLULARE E DELLA PROLIFERAZIONE. (Commessa: ME.P05.006)
Responsabile: Dott.ssa Alessandra Montecucco.
La replicazione del DNA occupa una posizione centrale nel ciclo cellulare ed è soggetta a numerosi meccanismi di controllo tesi a coordinarla con gli altri momenti della vita della cellula. L’obiettivo di questa unità di ricerca è di caratterizzare i meccanismi che controllano la replicazione del DNA sia nella fase di inizio che in quella di allungamento, sia durante la progressione del ciclo cellulare che in condizioni di stress replicativo. Un altro obiettivo è di utilizzare origini di replicazione del DNA umano come elementi costitutivi di vettori di espressione per applicazioni biotecnologiche.
- L’origine di replicazione associate al gene dalla Lamina B2 (LamB2-Ori) è in grado di prevenire il silenziamento genico. In collaborazione con la ditta Avantea sono stati messi a punto e validati vettori basati sul Lamb2-Ori e sulla tecnologia RMCE che hanno permesso l’espressione stabile del gene reporter EGFP in maniera stabile e durevole anche in assenza di pressione selettiva.
- Difetti in enzimi della replicazione possono indurre rotture della doppia elica durante l’evento replicativo. L’ipotesi di lavoro è che un aumentato livello basale di danni sul DNA possa influenzare l’espressione genica e l’identità cellulare. Per verificare questa ipotesi sono state utilizzate cellule umane mutate nel gene della DNA ligasi I che mostrano un aumentato livello basale di rotture del DNA prodotte durante la fase S in seguito ad una non corretta maturazione dei frammenti di Okazaki. Sono in corso esperimenti di biologia cellulare e molecolare, oltre che di RNA-Seq e ChIP-Seq, per comprendere l’impatto del danno sul DNA sui profili di espressione. Aumentati livelli di danno sul DNA si osservano normalmente nelle cellule tumorali, sia a causa di condizioni stressanti nel microambiente tumorale che per il sostenuto tasso di replicazione. Condizioni simili si verificano anche durante le prime fasi dell’embriogenesi. Questi studi possono aprire nuove prospettive per l'analisi i) dei programmi di differenziamento cellulare durante l’embriogenesi e 2) della progressione tumorale.
- Nell’ambito del progetto MbMM (CNR-Regione Lombardia), in collaborazione con l'Istituto di Neuroscienze del CNR (Milano), è stato recentemente intrapreso lo studio della risposta cellulare allo stress replicativo e al danno sul DNA in modelli cellulari di malattie neurodegenerative.
- La polimerasi eta è importante per i processi di tolleranza al danno dopo irraggiamento. Gli studi si concentrano sull’identificazione dei siti di fosforilazione della polimerasi eta e di nuove proteine interattrici. I dati ottenuti suggeriscono che queste modificazioni siano parte di un complesso network regolativo. Il principale interattore analizzato è la ubiquitin ligasi UBR5, identificata tramite spettrometria di massa. L’assenza di questa proteina altera la velocità delle forche replicative. Sono in corso studi di biologia molecolare e cellulare per comprendere i meccanismi alla base di questo effetto.

PATOGENESI DELLE MALATTIE DEGENERATIVE MUSCOLO-SCHELETRICHE (commessa ME.P05.014)
Responsabile: Dott.ssa Giovanna Lattanzi
Le attività di questa unità di ricerca hanno carattere interdisciplinare e traslazionale e sono basate sulle competenze acquisite nel campo delle patologie neuromuscolari e ossee grazie alla costante collaborazione con gli Istituti Ortopedici Rizzoli di Bologna e con gruppi di ricerca Europei e internazionali coinvolti nello studio di patologie genetiche a carico del sistema muscolo-scheletrico. Tali collaborazioni rendono disponibili campioni biologici che, grazie alla collaborazione con centri di genetica, permettono di indentificare nuove mutazioni patogenetiche.
Lo studio delle patologie degenerative muscolo scheletriche è articolato in tre filoni di ricerca principali e in parte tra loro complementari.
A) Patologie muscolari causate da mutazioni di geni della matrice extracellulare e del sarcolemma;
B) Distrofie muscolari, patologie ossee e cardiomiopatie associate a mutazioni del gene della lamina A/C, patologie comprese nel più vasto gruppo delle laminopatie;
C) Patologie osteoarticolari con particolare attenzione a possibili approcci terapeutici basati sull'uso di biomateriali per impianto ortopedico
In linea con la collaborazione con l’Istituto Ortopedico, parte dell’attività di ricerca si occupa di identificare nuovi approcci terapeutici per queste patologie.
Ad esempio lo studio del coinvolgimento dei processi autofagici nelle laminopatie con coinvolgimento osseo, ha permesso di dimostrare che l'induttore di autofagia rapamicina contribuisce all'invecchiamento sano. E’ stato inoltre possibile identificare un nuovo farmaco a bassa tossicità per il trattamento della sindrome di Ulllrich in a cui contribuisce una nuova isoforma di collagene VI responsabile del della fragilità dei legamenti sottoposti a stress meccanico.
Grazie alla collaborazione con i centri del Network Italiano Laminopatie è stato pubblicato uno studio molto ampio sugli aspetti clinici e molecolari di una coorte di pazienti affetti da distrofia di Emery-Dreifuss. Questo studio ha permesso di identificare nuove forme di distrofia muscolare di Emery-Dreifuss legate a mutazioni delle proteine SUN1/2 che sono coinvolte nel posizionare il nucleo all’interno della cellula. Inoltre, è stato evidenziato il ruolo della proteina centromerica pericentrina nella patogenesi della malattia muscolare.
Nell'ambito dello studio dei biomateriali da impianto ortopedico, sono stati studiati gli effetti di questi materiali sulla proliferazione delle cellule mesenchimali ed il coinvolgimento degli esosomi i questi effetti.
Infine, per quanto riguarda l'analisi delle protesi ortopediche soggette a danni da usura, è stata stabilita una correlazione tra presenza di frammenti protesici nel liquido sinoviale e presenza di cobalto e cromo nel circolo sanguigno.

BIOLOGIA COMPUTAZIONALE (commessa ME.P07.005).
Responsabile: Dott.ssa Silvia Bione
La comprensione dei meccanismi biologici implicati nella regolazione genica e nell'insorgenza delle patologie umane richiede oggi l'utilizzo di approcci bioinformatici e biostatistici in grado di interpretare ed integrare l'enorme quantità di informazioni ottenute mediante approcci "omici".
Diversi sono gli interessi di questa commessa:
- In collaborazione con l'Istituto Neurologico Carlo Besta di Milano e diversi gruppi di ricerca europei ed americani vengono studiate le basi genetiche delle malattie cerebrovascolari per identificare la componente genetica nell'eziologia dell'ictus ischemico a partire da dati genotipici a livello dell'intero genoma.
- In collaborazione con altri ricercatori dell'IGM, sono analizzati dati di espressione di mRNA e microRNA in sistemi cellulare in-vitro che ricapitolano le fasi della trasformazione tumorale. Inoltre vengono sviluppati studi sull’effetto che il danno sul DNA ha sull’organizzazione epigenetica e sull’espressione genica in cellule umane.
- In collaborazione con il gruppo del Dott. Pirastu di Sassari vengono svolti studi epidemiologici sulla sindrome metabolica (SM) in Ogliastra.
- In collaborazione con i ricercatori dell'IMATI-CNR è stato implementato un sistema di calcolo parallelo ad alta prestazione. Sempre in collaborazione con l'IMATI-CNR è stato sviluppato e reso accessibile alla comunità scientifica (http://www.igm.cnr.it/cabgen/web-correlagenes0/) un nuovo strumento web mirato all'identificazione funzionale tra geni.
- La commessa svolge anche attività di supporto alle applicazioni informatiche dell'Istituto. Sono state implementate nuove funzionalità al portale web dell'Istituto con l'introduzione di estensioni personalizzate alle esigenze interne e la creazione di database accessibili all'utenza interna ed esterna. In particolare sono stati realizzati, gestiti e ottimizzati i siti web del "Network Italiano Laminopatie-Rete italiana di centri di diagnosi e studio"; della Fondazione Adriano Buzzati-Traverso e del MbMM "Metodologie di base per la terapia e la diagnosi di Malattie Multifattoriali" (Progetto CNR-Regione Lombardia).

STUDIO DELLA REGOLAZIONE POST-TRASCRIZIONALE DELL'ESPRESSIONE GENICA IN RISPOSTA A STRESS. FATTORI CHE CONTROLLANO LO SPLICING DEI PRE-mRNA IN CELLULE NORMALI E NEI TUMORI. (Commessa: SV.P13.001)
Responsabile Dott. Giuseppe Biamonti
E’ sempre più evidente che il metabolismo dell’RNA agisce a diversi livelli nel definire la fisiologia cellulare.
- Uno di questi è lo "splicing alternativo" (AS), un complesso meccanismo di maturazione dei trascritti che espande la capacità codificante del genoma producendo mRNA differenti a partire da un unico trascritto genico primario. Rappresenta perciò un meccanismo di regolazione dell’espressione genica ideale per modulare l'identità cellulare in ripsosta a stimoli sia fisiologici (sviluppo, fattori di crescita) che patologici (condizioni stressanti come ad esempio nei tumori). La sua importanza è dimostrata dal fatto che circa il 92% dei geni umani subiscono eventi di AS. AS è controllato da proteine che legano specifiche sequenze di RNA.
Viene investigato il ruolo di AS nei tumori con l'obiettivo di decifrare la complessa rete di interazioni che regolano AS in risposta a stimoli esterni e la deregolazione nei tumori. In particolare, viene studiata la relazione tra AS e la transizione epitelio-mesenchimale (EMT) che riveste un ruolo chiave nella formazione di metastasi ma anche la modulazione dello splicing in relazione a condizioni stressanti che si verificano nel microambiente del tumore, come ad esempio ipossia o mancanza di fonti di carbonio e di energia. Questi studi stanno rivelando una profonda connessione tra neurogenesi e formazione dei vasi sanguigni che si attua proprio attraverso eventi di splicing alternativo.
- Il metabolismo dell’RNA gioca un ruolo chiave anche nell’insorgenza del danno sul DNA come ad esempio nel caso di un conflitto tra apparato di trascrizionale e replicativo. Una situazione che sembra avere un ruolo in una serie di patologie neurodegenerative provocate dalla mutazione della DNA/RNA elicasi Sen1 in grado di prevenire questi conflitti. Gli studi di genetica e biologia molecolare vengono eseguiti nel modello di lievito.
- Infine gli RNA non codificanti sia piccoli che lunghi sembrano avere un ruolo nel modulare l’organizzazione della cromatina in risposta allo stress termico o al danno sul DNA. In questo ambito è stato possibile dimostrare che l'induzione di un DSB causa la sintesi di nuovi trascritti di RNA emergenti dal sito di taglio che sono necessari all'attivazione della DNA damage response (DDR). La trascrizione è un evento a monte della cascata e ogni focus riparativo evidenziabile per microscopia è in realtà costituito da un complesso di proteine ed RNA molti dei quali molto brevi (dell’ordine di 20 nt) originati dal macchinario dell’RNA interference.
- L’ultima attività riguarda lo studio attraverso culture tridimensionali di cellule di tumori cerebrali umani riaggregate (neurosfere, sferoidi) per studiare il fattore Shc3. Gli studi sui tumori neuronali hanno permesso anche di arrivare ad importanti conclusioni sulle aree che controllano il linguaggio.

ANALISI DELLE MODIFICAZIONE EPIGENETICHE CHE INFLUENZANO L’INTEGRITÀ E STABILITÀ DEL GENOMA UMANO (Progetto bandiera: Epigen)
Quest’attività si avvale della competenza di ricercatori associati a diverse unità di ricerca (commesse) e si configura come una attività di Istituto.
L'integrità del genoma è continuamente minacciata da sorgenti di danno al DNA, siano esse esogene o endogene. Per fare fronte a queste tipologie di danno e alle conseguenze che ne scaturiscono a livello biologico, le cellule hanno evoluto dei meccanismi di sorveglianza e riparo del danno, i quali sono strettamente connessi con i meccanismi di replicazione e trascrizione. È noto che alterazioni in questi meccanismi di sorveglianza possono produrre eventi deleteri quali la proliferazione incontrollata o la morte cellulare. Un numero crescente di lavori suggerisce che la risposta al danno sul DNA coinvolga RNA binding proteins (RBPs) note per regolare i profili di splicing alternativo.
I principali obiettivi di questo progetto di ricerca sono:
1) Studiare con approcci genome-wide le modificazioni epigenetiche legate alla riparazione del DNA in cellule proliferanti.
2) Chiarire le relazioni tra PTM degli istoni e trascrizione/profili di splicing in risposta al danno sul DNA.
3) Studiare gli effetti di alterazioni dei meccanismi di riparazione del DNA sull'organizzazione epigenetica e il loro impatto sulla regolazione dell'espressione genica (trascrizione e splicing).
Come modelli cellulari vengo utilizzati:
1- Cellule 46BR.1G1 stabilizzate da un paziente con una sindrome causata da aplo-insufficienza dell'enzima replicativo DNA ligasi I.
2- Cellule XP30RO derivanti da un paziente affetto dalla sindrome Xeroderma pigmentosum variante (XP-V) caratterizzata da predisposizione ai tumori. Queste cellule sono difettive nell'attività della DNA polimerasi eta, un enzima coinvolto nella replicazione del DNA attraverso le lesioni indotte dalle radiazioni UV.
3- Cellule di pazienti affetti da tricotiodistrofia (TTD), una malattia ereditaria caratterizzata da mutazioni in geni che codificano subunità (XPD, XPB e TTD-A) del fattore generale di trascrizione IIH (TFIIH) il quale oltre ad intervenire nella riparazione dei danni indotti dalle radiazioni UV è anche coinvolto nella trascrizione.
Vengono eseguiti esperimenti di Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) e il DNA viene sequenziato presso l’Istituto di Genomica Applicata (IGA) di Udine.
I dati di ChIP-seq sono stati analizzati da CabGen il servizio di calcolo computazionale e di bio-informatica dell'IGM. Per questo sono stati implementati una serie di programmi per l'analisi sia del trascrittoma che dei dati di ChIP Seq.
 
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