Analisi Proteomica di tessuti e fluidi biologici bovini (2002)  

La definizione del quadro molecolare completo del funzionamento di una cellula, ha sollecitato studi su una grande varietà di organismi viventi, volti a determinare l’intero quadro di espressione delle proteine. Differenti progetti Proteoma sono stati avviati nel mondo ed il loro interesse cresce con la disponibilità dei dati di sequenza genica. Infatti, noti tutti i geni di un organismo, per una corretta comprensione delle basi molecolari che regolano la sua vita, risulta fondamentale lo studio delle sequenze geniche realmente espresse in ciascun tipo di cellula, tessuto e/o fluido biologico e della struttura finale delle rispettive catene polipeptidiche sintetizzate. Nulla era noto, finora, del quadro completo di espressione delle diverse proteine presenti nei fluidi fisiologici e/o organi di bovino, sebbene un gran numero di sequenze nucleotidiche (circa 5000) fosse stato depositato nelle banche dati. Lo studio realizzato presso il nostro Istituto è venuto a colmare proprio tale lacuna. Gli esperimenti sono stati eseguiti su bovini di razza Frisona, la più diffusa al mondo, al fine di avere una maggiore rappresentatività a livello numerico dei dati ottenuti. Alcuni tessuti e/o fluidi biologici sono stati omogeneizzati e le componenti proteiche sono state estratte secondo procedure convenzionali. L’impiego di tecniche di elettroforesi bidimensionale (2D-PAGE) ha permesso la risoluzione delle migliaia di componenti polipeptidiche presenti in ciascun campione. Sono state così definite le mappe 2D-PAGE di riferimento per fegato, rene, muscolo scheletrico, plasma e globuli rossi di bovini sani. Le singole specie molecolari, prelevate da gel, sono state identificate mediante procedure avanzate di spettrometria di massa biomolecolare. Per queste analisi sono state utilizzate tecniche di ionizzazione mediante desorbimento assistito da matrice indotto da laser (MALDI) e/o mediante electrospray (ESI), su campioni sottoposti o meno a preventiva separazione microcromatografica.
CONTINUA nella scheda 30.01

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Documento - focus.doc

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Analisi Proteomica di tessuti e fluidi biologici bovini (2002)  

CONTINUA dala scheda 30.00
Nonostante la limitatezza dei dati disponibili sul genoma bovino, rispetto a quelli relativi a uomo e topo, sono state identificate le proteine più abbondanti in ciascun tessuto. In particolare, è stato ottenuto esito positivo per diverse centinaia di specie proteiche che sono state così associate ai rispettivi geni. I dati ottenuti potranno in futuro risultare basilari per la corretta comprensione dei complessi processi fisiologici e/o metabolici che regolano l’adattamento di quest’animale consentendo, al tempo stesso, l’identificazione di componenti proteiche e quindi di attività enzimatiche peculiari per la sua vita. Sono in corso analisi degli stessi tessuti per animali portatori di malattie ricorrenti nell’allevamento. Tali ricerche stanno evidenziando una variazione del profilo proteomico specifica per ciascun tipo di infezione e si sta procedendo all’identificazione delle proteine associabili a ciascuno stato patologico. Tali marcatori molecolari consentiranno di formulare, in futuro, nuove ipotesi a livello molecolare per queste malattie. Va, inoltre, ricordato che diversi prodotti di lavorazione di fluidi e/o tessuti bovini sono quotidianamente assunti dall’uomo durante la sua alimentazione. Una completa caratterizzazione della componente proteica di ciascuna materia prima risulta di fondamentale interesse per qualsiasi considerazione di natura nutrizionale e salutistica per l’uomo. I dati fin qui ottenuti sono stati resi disponibili alla comunità scientifica creando un sito WEB dedicato di consultazione (http://www.iabbam.na.cnr.it/biochem), collegato agli altri 2D-PAGE databases presenti sulla rete e consorziati al WORLD-2D-PAGE database. L’utente, avvalendosi dei risultati da noi conseguiti, potrà, dopo aver realizzato il suo esperimento 2D-PAGE nelle condizioni sperimentali ivi descritte, analizzare direttamente on line i suoi esperimenti e confrontare i dati ottenuti con quelli presenti sul sito. Nuove proteine identificate nel tempo da parte del nostro laboratorio saranno rese disponibili sul sito.

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La mappa citogenetica nel miglioramento genetico del bufalo domestico (Bubalus bubalis, 2n=50) (2003)  

Dopo la costruzione e pubblicazione del cariotipo standard di bufalo (Iannuzzi, 1994) con ben sei diverse tecniche di bandeggio cromosomico, il laboratorio di Citogenetica Animale e Mappaggio Genetico dell’ISPAAM ha focalizzato parte della sua attività scientifica nel miglioramento genetico del bufalo, una specie di grande interesse economico nel mondo, con circa 130 milioni di capi, e in Italia, con circa 220.000 capi allevati soprattutto in Campania.
Gli studi hanno interessato sia aspetti di citogenetica clinica su bufale con problemi riproduttivi (il 22% delle bufale studiate presenta anomalie cromosomiche a carico dei cromosomi sessuali) che di citogenetica molecolare mediante il mappaggio fisico di numerosi loci mediante l’impiego di tecniche di ibridazione in situ in fluorescenza (FISH) e sonde di DNA contenenti sia marker di tipo I (geni espressi) che di tipo II (microsatelliti). E’ stata pubblicata un mappa citogenetica con 293 loci dei 31 gruppi di sintenia di bovino: 171 loci sono ti tipo I e 122 di tipo II. Tale mappa consente di estendere la nostra conoscenza nell’organizzazione fisica del genoma di tale specie e rappresenta un utile strumento per:
(a) studi comparativi con altri genomi (uomo e bovino) per i quali si dispone di mappe genetiche e citogenetiche più ricche e del sequenziamento di tutti i geni;
(b) la selezione assistita dei riproduttori con marker molecolari;
(c) la diagnosi di anomalie cromosomiche;
(d) la selezione di regioni cromosomiche contenenti geni di interesse zootecnico (produzioni e resistenza alle malattie).
In particolare, l’ordine dei loci riscontrato in alcuni cromosomi omologhi dei bovidi ha consentito di rivelare la prima mutazione autosomica che ha differenziato gli automi dei bovidi. Infatti, una regione prossimale del cromosoma 9 di bovino e bufalo (sottofamiglia Bovinae) è traslocata nella regione prossimale del cromosoma 14 di capra e pecora (sottofamiglia Caprinae) (Iannuzzi et al. 2001). Inoltre, le mappe citogenetiche comparative dei cromosomi X di bufalo (acrocentrico), bovino (submetacentrico) e peocora (acrocentrico con evidenti piccole braccia) hanno potuto dimostrare che tale cromosoma ha avuto un’evoluzione molto più complessa degli autosomi mediante l’impiego di trasposizioni centromeriche (tra bovino e bufalo) e di almeno 4 trasposizioni coinvolgenti altrettante regioni cromosomiche tra specie appartenenti alle sottofamiglie Bovinae e Caprinae (Iannuzzi et al. 2000).

Immagine - Figura 1b.
Immagine - Figura 1.
Documento - Table 1.

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Formulazione del problema di sostituzione di un allevamento da latte mediante un processo decisionale Markoviano e la Programmazione Lineare. (2003)  

Il problema di sostituzione degli animali è stato affrontato più volte e con metodi diversi. Il metodo tradizionalmente usato per risolvere tale problema è di formularlo come un processo decisionale Markoviano e di ottimizzarlo usando la Programmazione Dinamica (PD). Ci sono, comunque problemi associati con l'uso della PD. La decisione di sostituire un animale si basa soltanto sulla performance attesa dell'animale uscente e di quello entrante. Perciò, informazioni riguardanti la performance degli animali in relazione al resto dell'allevamento sono state ignorate. Questo è specialmente rilevante quando l'allevatore cerca di aumentare la produzione attraverso la selezione genetica.
Una metodologia sviluppata (Yates e Rehman, 1998) suggerisce l'uso della Programmazione Lineare (PL) per risolvere il problema, ma il modello presentato è semplificato.
Lo scopo di questo progetto è stato di includere un maggior numero di stati iniziali per simulare una più grande variazione genetica e altri aspetti rappresentativi.
Parametri importanti stimati sono:
- l'età al primo parto che è stato visto essere un fattore significativo nel verificarsi delle mastiti;
- la stima di tassi di concepimento, sopravvivenza e mortalità dei vitelli, tasso di abbattimento, di successi al primo servizio e di fallimenti al concepimento;
- la predizione delle produzioni di latte annuali, la produzione di latte per tutti gli stati genetici e per tutte le parità e gli anni;
- i costi di allevamento, i prezzi del latte e della carne.
Il modello è stato sviluppato in un orizzonte di pianificazione di 15 anni. Poiché il miglioramento genetico, in termini di produzione di latte, di un singolo individuo è differente da quello di qualunque altro, è stato possibile raggruppare animali in fasce similari in base alla loro produzione di latte. In questo modello sono stati presi in considerazione due livelli di produzione diversi (alto e basso) e mucche con 7 differenti parità (età in termini di lattazione).
L'aumento della resa di latte dell'allevamento dipende anche dal tasso di concepimento e di mortalità, conosciuto comunemente come "tasso di rimpiazzo". Questo ricambio genetico è perciò un processo graduale dipendente dallo stato passato, presente e futuro dell'allevamento. Prima di specificare il processo decisionale Markoviano coinvolto in questo modello, è stato necessario, definire prima tutti i possibili stati genetici in un periodo di 15 anni che sono 584, il modello così specificato è stato costruito con l'ausilio di XPRESS, un pacchetto di software che risolve problemi di PL.
Sono stati inclusi anche fattori quali terreno, capitale, mano d'opera e richieste nutrizionali.
La soluzione proposta può essere vista come un'innovazione da introdurre nelle aziende da latte di aiuto ai produttori nel prendere decisioni tese ad ottimizzare la gestione sia da un punto di vista economico che tenendo presenti i vari problemi che possono sopraggiungere in una pianificazione a lungo termine.

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La mappa citogenetica nella pecora domestica (Ovis aries, 2n=54) (Animal Genetics, 2007) (2007)  

La pecora (Ovis aries, 2n=54) costituisce una delle specie zootecniche economicamente più importanti al mondo, specie nell’area mediterranea. Benché siano disponibili sia mappe di linkage che da ibridi di radiazione, le mappe citogenetiche reperibili nei siti WEB sono tuttora molto povere e costruite, tra l’altro, su vecchi cariotipi standard. La costruzione dei recenti cariotipi standard dei bovidi domestici, tra i quali quello della pecora, basati sia su modelli bandeggiati ad alta risoluzione, marker molecolari e nomenclature di bande cromosomiche omologhe, ci ha consentito di presentare una mappa citogenetica della pecora con 452 loci, la maggior parte dei quali mappati nel nostro laboratorio mediante la tecnica FISH su cromosomi badeggiati con bande di tipo R. Tale mappa citogenetica sarà di grande utilità sia nella citogenetica clinica (studio delle anomalie cromosomiche e loro relazione con la fertilità), nella citogenetica molecolare (confronto di mappe citogenetiche – ordine dei loci- tra specie affini e non), nella citogenetica evolutiva (studio dei rimaneggiamenti cromosomici che hanno differenziato le specie nel corso della loro evoluzione) e nell’ancoraggio fisico a specifiche regioni cromosomiche sia delle mappe di linkage che da ibridi di radiazione.

Documento - An advanced sheep (Ovis aries, 2n =
Documento - Tabella Loci Mappati

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Biomonitoraggio ambientale mediante test citogenetici su animali allevati al pascolo in zone a rischio (Mutagenesis 2006) (2007)  

Gli animali domestici, specie quelli allevati al pascolo, rappresentano delle vere e proprie sentinelle ambientali in quanto, alimentandosi di specie vegetali e terreno (quest’ultimo assunto insieme ai vegetali) presenti nel luogo di allevamento, danno un’idea del grado di contaminazione dell’ambiente e, quindi, della catena alimentare. Infatti, molte sostanze mutagene presenti nell’ambiente passano, attraverso i prodotti animali, all’uomo ponendo le basi per l’insorgenza di alterazioni del quadro clinico (disturbi riproduttivi, ormonali ed immunitari). Controllare tali animali significa, quindi, controllare la catena alimentare e, indirettamente, anche la salute umana. E’ noto che molte sostanze mutagene lasciano chiari segni a livello cromosomico (gap, rotture cromosomiche e cromatidiche, frammenti) che denotano genomi potenzialmente esposti a mutazioni genetiche (errate divisioni cellulari sia a livello mitotico che meiotico). Studi citogenetici condotti su pecore allevate nella provincia di Napoli ed esposte sia a bassi che alti livelli di diossine hanno rivelato una spiccata fragilità cromosomica risultata essere, rispettivamente 4, 8 e 14 volte in pecore esposte, rispettivamente a 5, 39 e 51 pg/g di grasso di diossine, rispetto a quella rinvenuta in pecore di controllo (non esposte alle diossine). Anche i livelli di scambi intercromatidici (SCEs) sono risultati significativamente più alti (P<0,001) nelle pecore esposte alle diossine, rispetto a quelli riscontrati nei controlli.

Immagine - Metafase con SCEs
Immagine - Metafase con rotture cromatidiche
Documento - Tabelle diossine

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