La Forza per controllare lo stress (2002)  

I batteri e i sistemi biologici hanno svariati meccanismi per rispondere alle perturbazioni causate dall'ambiente circostante. Gli stress possono essere di vario genere, chimico, biologico e fisico. Recentemente sono stati identificati i meccanismi con cui le cellule riescono a "sentire" le forze fisiche provenienti dall'ambiente circostante. Alla base di questi meccanismi si trovano delle proteine-canale di membrana che possono aprirsi e chiudersi in risposta a diversi stimoli esterni come tocco, suono, gravità, variazioni di osmolarità etc. I Mechanosensitive Channels of Large Conductance (MscL) sono le proteine di membrana meglio caratterizzate che giocano un ruolo fondamentale nella difesa della cellula. I MscL formano un canale all'interno della membrana cellulare, che si apre e chiude, favorendo o sfavorendo rispettivamente, il passaggio di effluenti dall'esterno all'interno della cellula (o vicecersa). La loro struttura tridimensionale, risolta da D. Rees (Science 1998), è riportata in Figura 1. La proteina è costituita da unità ripetitive e si trova nella sua forma chiusa. La domanda fondamentale per capire il modo in cui le cellule interagiscono fisicamente con l'ambiente circostante è: qual è il meccanismo con cui il canale si apre lasciando passare effluenti all'interno della cellula? A questa domanda si può rispondere simulando a livello computazionale con i metodi della dinamica molecolare l'applicazione diretta di forze alla proteina in un intorno realistico. La dinamica molecolare è una tecnica che permette di seguire l'evoluzione nel tempo di sistemi microscopici, ottenendone una rappresentazione con dettaglio atomico. Con parametri opportuni si definiscono le interazioni tra atomi del sistema, e l'evoluzione avviene secondo le leggi della meccanica classica. Abbiamo quindi costruito un sistema modello costituito dalla proteina nella forma chiusa, da un modello della membrana cellulare e del solvente acquoso circostante (Figura 2). Il sistema è stato fatto evolvere in presenza di forze di stretching agenti sulla membrana ed in assenza di queste, allo scopo di investigare le fasi iniziali del meccanismo di apertura del canale. L'analisi delle varie simulazioni ha permesso di ottenere una rappresentazione atomica del meccanismo di apertura, in cui, a causa dell'applicazione di tensione esterna, due delle eliche esterne si aprono, lasciando lo spazio per il posizionamento di una delle eliche interne. Il risultato netto è un allargamento dell'apertura del canale (Figura 3) ed il passaggio di acqua da una parte all'altra della membrana (Figura 4). Questo lavoro, che ha richiesto un uso intensivo di metodi di parallel computing e di tempo macchina, ha permesso di chiarire il meccanismo con cui avviene l'apertura di questi canali e di definire il modo in cui i sistemi biologici possano rispondere agli stress ambientali. Gli sviluppi futuri prevedono di utilizzare questi modelli per la costruzione di nanostrutture capaci di rispondere selettivamente a stress meccanici esterni, e per la realizzazione di mutanti ad attività differente rispetto a quella delle proteine native. La ricerca è stata il frutto di una collaborazione tra l'ICRM-CNR e il gruppo di MD dell'università di Groningen, ed è stata possibile grazie a finanziamenti CNR e dell'Unione Europea.

Immagine - Figura 1
Immagine - Figura 2
Immagine - Figura 3
Immagine - Figura 4

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Enzimi fuor d'acqua (2002)  

Gli enzimi sono proteine che catalizzano le reazioni chimiche indispensabili per gli esseri viventi. Esercitano la loro azione in condizioni blande e mostrano proprietà molto utili per la sintesi di composti chimici di interesse farmaceutico, agrochimico o alimentare. Fino ai primi anni '80 si pensava che gli enzimi fossero attivi solo in acqua, in cui la maggior parte delle molecole organiche è poco solubile, e che i solventi organici distruggessero il loro potere catalitico. Per ovviare a questa incompatibilità di mezzo di reazione tra catalizzatori e reagenti, i primi gruppi di ricerca attivi nella cosiddetta "biocatalisi" - tra cui quello presente nel nostro Istituto dall'inizio degli anni '70 - hanno condotto reazioni in presenza di quantità crescenti di solventi organici. Inizialmente sono stati utilizzati co-solventi miscibili (es. acetone), poi si è passati a solventi non miscibili che formano sistemi bifasici acqua/solvente organico (es. toluene) in cui la fase organica contiene i substrati e/o i prodotti mentre l'enzima è disciolto nella fase acquosa (Figura). Riducendo progressivamente la fase acquosa si è arrivati all'utilizzo di solventi organici puri: il biocatalizzatore, liofilizzato o precipitato, viene sospeso nei solventi in presenza della minima quantità di acqua necessaria per garantire l'attività catalitica. In queste condizioni non è possibile osservare una fase acquosa distinta, poiché la sua concentrazione è inferiore al valore massimo della sua solubilità nel solvente organico. Con iniziale sorpresa si è scoperto che in queste condizioni estreme non solo gli enzimi continuano a "funzionare" ma presentano anche nuove proprietà quali l'aumento della termostabilità, la possibilità di catalizzare reazioni di sintesi anziché di idrolisi o di modulare la loro regio- ed enantioselettività.
I ricercatori del nostro Istituto, dopo aver svolto un ruolo pionieristico nell'uso di enzimi in sistemi bifasici, sono da anni impegnati nello studio della biocatalisi in solventi organici puri, sia per trasformare substrati non naturali su scala preparativa che per ottimizzare le condizioni di reazione, in particolare relativamente alla formulazione degli enzimi. Analizzando le cause che concorrono ad una minore attività degli enzimi e studiando le loro prestazioni una volta immobilizzati o adsorbiti su idonei supporti o in presenza di additivi attivanti, è stato possibile ottenere formulazioni enzimatiche che mostrano un'attività catalitica simile, o in alcuni casi perfino superiore, a quella mostrata dagli stessi biocatalizzatori in acqua. Tutto questo ha permesso non solo di acquisire conoscenze di base sul funzionamento degli enzimi, ma di sviluppare nuove metodologie facilmente trasferibili a laboratori di ricerca accademici ed industriali, nonché utilizzabili per la produzione di molecole di interesse per la chimica fine. Le ricerche sono state finanziate dal CNR, dalla Comunità Europea e da industrie farmaceutiche italiane.

Immagine - Figura
Documento - Enzimi fuor d'acqua

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Analisi strutturale e funzionale dei domini della molecola di adesione distroglicano. (2003)  

_DISTROGLICANO: background
Il distroglicano (DG) e' codificato da un singolo gene [1-3] ed e' altamente conservato nei vertebrati. Recentemente, ortologhi del DG sono stati identificati anche negli invertebrati [4,5]. Il DG viene prodotto come un'unica catena polipeptidica che viene poi tagliata nelle due subunita' alfa- e beta-DG, con un processo proteolitico post-traduzionale che avverrebbe gia’ nel reticolo endoplasmatico e i cui dettagli molecolari sono ancora poco chiari [6]. L' alfa-DG e' una proteina periferica di membrana fortemente glicosilata che lega diverse molecole quali la laminina, l' agrina, i perlecani, la neurexina e i biglicani [2].
Il DG viene espresso in un' ampia varietà di tessuti oltre al muscolo, per esempio negli epiteli, nel sistema nervoso centrale e periferico [7]. Il peso molecolare previsto per l' alfa-DG e' di circa 72 kDa ma quando la proteina e' isolata da tessuti diversi mostra una eterogeneita' nelle dimensioni.
Queste differenze sono dovute probabilmente al diverso grado di glicosilazione che varia anche nello stesso tipo di cellula. L' alfa-DG interagisce in modo non covalente con la subunità beta, il beta-DG. Il beta-DG e' una proteina transmembranaria di 43 kDa; la sua regione citoplasmatica interagisce con la distrofina, con alcune sue isoforme piu' corte, con l' utrofina, e con altre molecole coinvolte in meccanismi di trasduzione del segnale [12-14]. Il beta-DG interagisce non covalentemente con l’ alfa-DG e con il complesso dei sarcoglicani tramite il suo dominio extracellulare [15]. Il DG costituisce un legame tra il citoscheletro e la matrice extracellulare ed e' di cruciale importanza per la stabilita' strutturale della membrana plasmatica [16]. L ' importanza del complesso del DG emerge in modo evidente in gravi forme di distrofia muscolare (in particolare, Duchenne, Becker e distrofie congenite), nelle quali viene frequentemente osservata l’ assenza (che potrebbe dipendere anche dal loro “targeting anomalo”) delle subunita’ del DG e dell’ intero DGC. Questo fenomeno e’ considerato uno dei fattori principali a livello molecolare che portano all’ instabilita', all' indebolimento progressivo e alla successiva necrosi delle fibre muscolari. Il DG gioca un ruolo essenziale anche nell' assemblaggio della prima membrana basale extraembrionale nella morfogenesi dei mammiferi: gli embrioni di topo privi del gene del DG hanno lo sviluppo embrionale arrestato precocemente, 6.5 giorni, quando viene depositata la prima membrana basale extra-embrionale, membrana di Reichert [17]. _DISTROGLICANO: il nostro contributo.
La nostra Unita' di Ricerca, ha compiuto una lunga serie di studi sul complesso del distroglicano e sulla sua organizzazione molecolare in domini [18-20]. In particolare, sono stati compiuti ampi progressi nella conoscenza a livello molecolare dell' interazione tra le subunita' del complesso, alpha-DG e beta-DG [21-23]. Inoltre sono stati gia’ preparati ed utilizzati sia degli anticorpi policlonali che monoclonali a partire da peptidi ricombinanti o sintetici corrispondenti a specifiche regioni dell’ alfa-DG [24].

Immagine - Dystrophin glycoprotein-complex
Immagine - Dystroglycan Complex
Immagine - Binding
Immagine - NMR
Documento - Referenze Bibliografiche

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Aromi e fragranze (2003)  

Aromi e fragranze accompagnano la maggior parte delle attività quotidiane di ognuno di noi. Queste sostanze si trovano negli alimenti, nelle bevande, in tutti i prodotti per l’igiene personale, nei detersivi, nei detergenti e ovviamente nei profumi e nei deodoranti. La molteplicità delle applicazioni possibili ha richiesto una considerevole differenziazione chimica degli ingredienti utilizzati in commercio ed ha implementato la rilevanza economica dell’industria degli aromi. Inoltre, negli ultimi anni, l’industria ha puntato alla sintesi di composti sempre più efficaci e più specifici, di elevato valore, biodegradabili ed utilizzabili in piccole quantità. Questo andamento è il riflesso di un’aumentata sensibilità ambientale volta alla riduzione dei ‘chemicals’ immessi nell’ambiente. Nel contesto della creazione di nuovi composti odorosi la ricerca chimica ha un ruolo fondamentale in quanto è necessaria non solo per l’aspetto preparativo ma anche per lo sviluppo qualitativo del prodotto. I composti utilizzati infatti, sono spesso miscele complesse di isomeri con caratteristiche olfattive singolari la cui esatta valutazione organolettica è subordinata alla preparazione specifica di ogni componente.
In questo ambito il nostro Istituto si è occupato sia dello sviluppo di nuovi metodi sintetici che della preparazione stereospecifica di aromi e fragranze. Questo lavoro ha richiesto la sinergia di differenti competenze e metodologie quali l’impiego della sintesi asimmetrica e della biocatalisi per la preparazione di composti olfattivamente attivi in forma enantiopura nonché dell’uso di tecniche analitiche e spettroscopiche per la determinazione della struttura molecolare. In particolare si sono raggiunti risultati di notevole valore scientifico nel campo dei composti di origine terpenica (monoterpeni, norterpenoidi, sesquiterpeni) nonché nel campo dei sistemi eterociclici ossigenati. Un progetto rilevante ha riguardato ad esempio la preparazione enantiospecifica degli ironi, ovvero i composti norterpenoidici utilizzati da secoli nella profumeria fine come aroma di viola. Queste sostanze, estratte dalle radici dell’iris, sono estremamente costose ma vengono ancora utilizzate in quanto di maggior pregio se comparate con il corrispondente più economico prodotto sintetico. Grazie all’applicazione combinata della sintesi chimica e di processi enzimatici è stato possibile preparare tutte le forme isomeriche di queste sostanze.
La successiva valutazione olfattiva da parte di esperti ha evidenziato che esistono differenze organolettiche sostanziali tra le forme isomeriche tali da giustificare la disuguaglianza qualitativa tra il prodotto naturale e quello sintetico. I risultati ottenuti permettono di ricreare per sintesi una composizione del tutto identica (o qualitativamente superiore) a quella naturale. Lo studio sopra descritto ed altri analoghi hanno permesso ai ricercatori del nostro Istituto di acquisire conoscenze specialistiche in questo campo e di sviluppare nuovi metodi di sintesi di rilevanza scientifica ed industriale. Queste attività hanno inoltre comportato un continuo scambio di conoscenze tra il mondo accademico e quello della produzione. Le ricerche sono state possibili grazie alla collaborazione col Politecnico di Milano e ditte operanti nella produzione di aromi e fragranze. I finanziamenti sono stati erogati dal CNR e dal MIUR.

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